[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因的克隆、表达及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术药物和基因技术领域，具体涉及一种新的柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因的克隆、表达及应用。

背景技术：

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防，但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。而研制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。本发明人以对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)为研究对象，开展了E.tenella孢子生殖发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究，为探索鸡球虫的入侵和生长发育机制，从而研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定基础。

蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。蛋白激酶和蛋白磷酸酶参与可逆性磷酸化过程，在调节代谢、基因表达、细胞生长、细胞分裂和细胞分化等方面起关键性作用。几乎所有的细胞内信号通路都是利用蛋白磷酸化产生信号并向远处传递。蛋白激酶催化蛋白质上磷酯键的形成，细胞蛋白质活性发生极大变化。形成的磷酯键性质非常稳定，去除时需要蛋白磷酸酶水解。细胞通过调节蛋白激酶与蛋白磷酸酶的动态平衡，产生一个限定时空的信号，并以一种高度特异性方式来影响蛋白质的活性状态，调节细胞功能。蛋白激酶是细胞内最大的蛋白家族之一。根据受体氨基酸的性质，蛋白激酶家族可以划分为4类：丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶、酪氨酸特异性蛋白激酶、组氨酸特异性蛋白激酶和天冬氨酸/谷氨酸特异性蛋白激酶。目前对丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶和酪氨酸特异性蛋白激酶的研究较多，这两种激酶有许多共同的特征：催化机制、结构特性、激酶调节机制都非常相似。

本发明人研究发现克隆的柔嫩艾美耳球虫新蛋白激酶(EtPK)基因编码的蛋白与利氏曼原虫(Leishmania infantum)蛋白激酶在337～505位氨基酸具有30％的同源性。保守区功能域检索发现该基因编码的蛋白在320～500位氨基酸间具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能域，是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶的磷酸转移酶亚家族。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是一类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族，包括蛋白激酶A(PKA)(cAMP依赖性蛋白激酶.)、蛋白激酶C(PKC)(Ca²⁺激活的/磷脂依赖性蛋白激酶)、Ca²⁺钙调蛋白依赖性蛋白激酶、DNA依赖的蛋白激酶、丝裂原激活的蛋白激酶等，参与多种信号传导过程。在鸡球虫中已经发现一些蛋白激酶，如柔嫩艾美耳球虫细胞周期依赖性蛋白激酶(EtCRK2)、环鸟苷酸依赖的蛋白激酶(EtPKG)、钙依赖蛋白激酶(CDPK)等，研究发现这些蛋白激酶在虫体入侵宿主细胞过程中起重要作用，另外也发现一些球虫蛋白激酶是研究抗球虫病化学药物的作用靶标。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于研究设计扩增柔嫩艾美耳球虫的一种新蛋白激酶(EtPK)基因及其应用。

本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因，该基因具有SEQ ID NO.1序列。

本发明以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊为驱动组，子孢子为实验组，利用抑制性消减杂交技术构建了子孢子的消减cDNA文库。从构建好的消减cDNA文库中挑选了1056个克隆，制作了cDNA微阵列(芯片)，将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子的总RNA制备探针，分别用cy3和cy5标记，通过芯片杂交、筛选获得了EtPK基因的EST序列，经实时定量RT-PCR检测，该基因在子孢子阶段高表达。利用RACE(cDNA末端快速扩增)技术首次克隆到了编码柔嫩艾美耳球虫一种新蛋白激酶(EtPK)基因含ORF的全长cDNA序列，构建了原核重组表达质粒(pGEX-4T-EtPK)，在大肠杆菌中进行了表达，纯化了重组表达蛋白，并对表达的重组蛋白进行了抗原性的鉴定。

本发明的另一目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因的克隆和表达。该方法包括下列步骤：

(1)试剂与材料