[发明专利]香菇栽培菌种241－4的分子标记、其检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属香菇栽培菌种的检测领域，特别是涉及香菇栽培菌种241-4的分子标记、其检测方法及应用。

背景技术

我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。

优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。

面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种香菇栽培菌种241-4的分子标记、其检测方法及应用，通过采用PCR技术，经过筛选试验，获得了香菇菌株241-4的特异DNA片断，以此片段的DNA序列为基础，设计特异性PCR扩增引物，通过对241-4菌株的特异片段检测从而对香菇241-4菌株进行鉴定和检测。

本发明的一种香菇栽培菌种241-4的分子标记，是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是241-4F/R，241-4F是5’CTCTGGTCATTGTTACTGTG 3’，241-4R是5’CTCTGGCAAGGCTTAT 3’，PCR产物大小为555bp。

扩增出的SCAR片段的基因序列如下：

5′-CTCTGGTCATTGTTACTGTGTTTATTGGAGTACTGAGCAACTACAAGACTCTGTAGCACAACCTACTGAGCTTGTATTAAGGCATTGACATTCTCTGCACTGAGCTGGGTGGCATACTGCTTGGGTTAGCTGAAGGGCGCTCCAGTGTGTTTCAACTTCAACAAGTGCAGTCTCCTTCAACACGGAATAGGAATCAATGGGTAATGTTTGAGATCTTCAGACGACTGAAAATCAATACACGATGAATAAAACTAATTAAACAAGAAAAGAAAAAGACCGAATACATGTACTAAAAACGAGGAACGATCTTCAAGGCTAACTCCCCATTGTTGGTTCAAGCTATCATGAAAGAAAGCCGGGAGTTTTTGGGATAAGAATGCTGCAGTGCAAGGTACATGTTCGGCAAACAAAGGGCAGTTAGCCCGACCGATCCAGAAATCGCGAATATAAATCTAAAATCAAAATCAATTAACAAGTTCGGTTGGAAAACCAGACAAACAAATACATACCAAGAATGGTGCCGCCTCCTCAAATAGAGCATAAGCCTTGCCAGAG-3′。

本发明的香菇栽培菌种241-4的分子标记的检测方法，包括下列步骤：

(1)菌丝培养

将4℃保藏的香菇菌种转接到PDA平板上，23℃～25℃避光培养，10d～14d后接到100mL PDY培养基中，100rpm～150rpm，23℃～25℃摇瓶培养10d～14d后收集菌丝，放入-20℃冰箱保冻备用；

(2)基因组DNA的提取

用改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取菌丝的基因组DNA：

1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀；

2)12000rpm，4℃离心20min，取上清液；

3)加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液(混合液的混合体积比为25∶24∶1)，轻轻混匀10min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中；