[发明专利]神经干细胞NSCs－NT3在修复神经元损伤中的应用

说明书

技术领域：

本发明涉及神经干细胞NSCs-NT3在修复神经元损伤及帕金森疾病引起的神经元损伤中的应用。

发明背景

帕金森病(Parkinson disease，PD)是由JameParkinson在1817年对该病的描述而得名。PD是中老年人群中最常见的神经变性病之一，全球超过2％的65岁以上老年人患有此种疾病，影响他们的晚年生活质量。因中枢神经系统神经递质代谢异常所致。PD的主要临床表现是静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓、平衡障碍。PD的主要病理学特征是黑质纹状体的多巴胺能神经元变性以及残存的神经元中出现路易小体(Lewy bodies，LB)和路易神经索(Lewy neuritis，LN)。

神经营养因子NT-3(neurotrophin-3)与神经结构和功能密切相关的家族蛋白，调控着神经元的发育、生长、分化和生存，对维持神经系统的正常功能承担着重要作用，也是内耳发育的最基本营养因子。神经营养因子不仅可以减少神经变性阻止疾病进程，而且还具有刺激轴突生长、促进再生的功能。研究表明，对于阿尔茨海默病、帕金森病(PD)、亨廷顿病、脊髓损伤和外周神经病变等，神经营养因子表现出能促进神经元的修复、轴突生长和功能性恢复的作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供神经干细胞系NSCs-NT3在修复神经元损伤中的应用。

本发明的目的之二在于提供神经干细胞系NSCs-NT3在修复帕金森疾病引起的神经元损伤中的应用。

神经干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞，其可通过对称或不对称分裂产生新的干细胞或分化潜能逐渐减小的子代细胞，并可最终产生中枢神经系统的三种细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在发育中的胚胎神经系统和成体脑特定区域都存在神经干细胞，其特性标志为一种中间丝状蛋白巢素蛋白(nestin)。本发明通过分子与细胞生物学方法建立神经干细胞系(NSCs-NT3)，将神经干细胞NSCs-NT3移植入帕金森模型大鼠脑部，研究帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)的修复治疗。最后，从大鼠行为水平观察到神经干细胞(NSCs-NT3)对大鼠帕金森模型的修复。实验表明：神经干细胞NSCs-NT3对帕金森病引起的损伤具有修复作用。

附图说明

图1是神经干细胞(NSCs)转染质粒pEGFP-C1-NT3，即建立了神经干细胞NSCs-NT3。

图2是RT-PCR(A)，Realtime PCR(C)，Western Blot(B)对NT3基因表达的研究。从mRNA和蛋白水平证明，神经干细胞NSCs-NT3中，NT3的表达上调。

图3是NSCs和NSCs-NT3在体外培养7天后，免疫组化检测其分化情况。从A，B可以看出，在转染了NSCs-NT3中的神经元明显比NSCs中多。红色表示神经元标记NF，绿色表示星型胶质细胞标记GFAP。和C相比，D中，大多数分化的神经干细胞表现为多巴胺能神经元TH阳性。H，I，J是E，F，G的放大。

图4是阿朴吗啡诱导(0.5mg/kg)的帕金森大鼠移植后的旋转分析。从图中可以看出，移植了NSCs-NT3的帕金森大鼠，旋转情况明显好于NSCs组和Vehicle组。

具体实施方式

本实施例的的神经干细胞(NSCs)，取自新生大鼠海马区域体外培养。

实施例一：帕金森病大鼠模型的建立

用10％的水合氯醛腹腔麻醉动物(40mg/kg)，头部固定于立体定向仪上，齿棒在耳中线下2.4mm。剪毛备皮，作头部正中切口，暴露颅骨外板，根据包新民和舒斯云大鼠脑立体定位图谱，在右侧前脑内侧束(MFB)(定位AP：4.4mm，LP 1.2mm，硬膜下7.8mm)和中脑被盖腹侧区(VTA)(定位AP 4.8mm，LP 1.0mm，硬膜下7.8mm)上方牙科钻开颅，暴露硬脑膜后，将微量注射器装在移动架上，向两点各注入含0.02％抗坏血酸的6-OHDA 8μg/4μl，注射速度为0.5μl/min，留置空针10min后缓慢退出。对照组两点注入含0.02％抗坏血酸的生理盐水。用生理盐水冲洗伤口，缝合皮肤，补液并于皮下注射青霉素。待动物苏醒后送至清洁级动物房饲养护理。

实施例二：神经干细胞NSCs的分离与培养。

无菌条件下取1～3天新生大鼠，浸泡于75％酒精中，至大鼠昏迷；

①D-Hanks倒入平皿中。