[发明专利]一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法，属于生物工程中免疫酶技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素(简称AFT)是一种真菌毒素，是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一种强毒性的次生代谢产物，现已查明凡能孽生黄曲霉真菌的物质，如粮食、油料作物的种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、黄麻、乳类、乳制品、肉类、鱼虾类、发酵品类和饲料中均有AFT的污染。

AFT理化性质非常稳定，在高温200℃及紫外线照射下，都不被破坏而且通过食物链的作用能从一种生物体转移到另一种生物体内，凡残留在家禽、家畜的肉、内脏、蛋、奶中毒素可随食物进入人体导致人类中毒或致癌，据世界卫生组织及上海市肿瘤研究所等有关部门报导黄曲霉毒素是引起肝癌的首位致癌因素，因此世界上许多国家对食品中黄曲霉毒素允许量都做了严格的限制。我国规定饲料和食品中黄曲霉毒素的允许值分别小于50PPb和20PPb，这就要求测定方法要有很高灵敏度。目前测定方法大致有：化学分析法、仪器分析法、生物鉴定法以及酶联免疫吸附法(ELISA)。

化学分析法中以薄层层析法最为常用，也作为我国对食品、饲料中黄曲霉毒素测定的国标法，其检测限为1-5PPb，但其检测时必须要用已知黄曲霉毒素标准品作对照，必要时通过用生物法作补充证实。

仪器分析法一般用高效薄层层析扫描仪或高效液相色谱法，其自动化程度高分辨率好，但仪器较昂贵，技术水平要求高，难以普及推广应用。

生物鉴定法由于特异性较差，灵敏度低，一般只作化学分析法的补充验证。以上三种方法样品前处理都较复杂，要提取与净化，排除样品中其它物质干扰以致特异性不强。

美国拉韦林(Lawellin)首先提出酶联免疫吸附分析法来测定黄曲霉毒素中毒性最强的结构B₁(羧甲基肟)来定性、定量黄曲霉毒素含量。目前国内外都以黄曲霉中毒性最强的结构B₁做为检控主要对象。由于此法特异性高，分析时间短，受到广泛的重视，后来有人又研究出用酶联免疫吸附分析法的“药盒”，一盒试剂可测多个检测样品，“药盒”在美国有购买，但价格也比较昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用简易、价廉、一体化的准确、快速检测黄曲霉毒素的方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法为：

一.标准试样制备

第一步，制备黄曲霉毒素AFB₁抗体包被反应板：

将抗黄曲霉毒素AFB₁多克隆抗体用50mmol/L-100mmol/L，Na₂CO₃-NaHCO₃PH9.6缓冲液稀释至3-5μg/ml的包被液，加入到反应板的48或96孔的试管中，每孔加100-110μL，3℃-5℃冰箱放置过夜，弃去包被液冲洗2次-4次，每孔中加200-250μL含1％牛血清白蛋白BSA的100-110mmol/L、PH7.4磷酸盐PBS缓冲液封闭35℃-40℃放2-4小时，弃其封闭液，将包被板真空包装后置-15℃--25℃冷冻保存；

第二步，制备酶标抗原：

取0.5～1mg黄曲霉毒素B₁-羧甲基肟AFB₁-omixe溶于20％乙醇溶液中，加入20-50mg乙二胺3.3-二甲胺丙基碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCL搅拌反应30分钟-60分钟，再以磷酸盐PBS 0.01M、PH7.4溶液透析2天-4天，得到酶标抗原原液；

第三步，制备黄曲霉毒素AFB₁标准溶液

将10％-20％甲醇的磷酸盐PBS PH7.4溶液为溶剂，配制0.1ng/ml-10ng/ml的AFB₁标准系列溶液；

第四步，制备样品稀释液

在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入10％-20％甲醇；

第五步，制备酶标抗原稀释液

在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入0.05-0.2％的牛血清白蛋白BSA；

第六步，制备洗涤液

在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入0.03％-0.07％的吐温-20 TW-20；

第七步，制备底物液a：

在乙酸钠——柠檬酸缓冲液PH＝5.0中加入0.1％-0.4％四甲基联苯胺TMB；

第八步，制备底物液b：