[发明专利]适于NSO细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基

说明书

【技术领域】

本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适 于NSO细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基。

【技术背景】

现代生物技术是21世纪重点发展的前沿技术之一。其中，利用动物细胞 培养技术生产具有重要医用价值的生长因子、疫苗和单抗等已成为医药生物 高技术产业的重要组成部分。为完善动物细胞培养技术，人们非常关注对培 养动物细胞的培养基的研究，因为，培养基是动物细胞培养技术的基础和关 键要素之一。在过去几十年里，随着科学技术的发展，动物细胞培养经历了 采用有血清培养基、无血清培养基和无蛋白培养基的几个阶段。

动物细胞培养是生产基因工程产品中的重要环节，研究发现，采用含有 血清的细胞培养基会给生产及科研带来许多不利因素：第一，影响细胞生长 及产品质量，存在批间差异；第二，易被支原体和病毒污染；第三，成分复 杂且不确定，给产物的分离纯化带来极大的困难；第四，血清的价格非常昂 贵，其费用通常占到培养基整体费用的50％以上，致使生产成本大幅度提高。 因此，血清在动物细胞大规模培养中的使用已受到了限制。

二十世纪50年代初，人们开始了对无血清培养基的研究；80年代后，无 血清培养基的研究取得了迅速的发展，多种能支持不同种类细胞生长的无血 清培养基见诸报端；80年代末90年代初，具有商业应用价值的无血清培养基 纷纷上市，其中有：

Darfler等人开发的CITTL无血清培养基〔以DMEM/F12(1∶1)为基础培养 基，添加了5mg/L的过氧化氢酶、1.5mg/L的胰岛素、1.5～3.0mg/L的转铁 蛋白、2nmol/L睾酮、0.5mg/L的二亚油酰磷脂胆碱和1.5mg/L的β-甘油磷 酸〕，该无血清培养基可支持s49细胞的生长，也可用于杂交瘤细胞的培养。 Chang等人(1980)用所报道的无血清培养基成功地培养了几株杂交瘤细胞。

Murakami等人开发的无血清培养基〔以DMEM/F12(1∶1)为基础，添加了 5mg/L胰岛素、2～35mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亚硒酸钠等 物质〕，这就是现在被广泛使用的DMEM/F12-ITES配方。

Kover和Frank开发的无血清培养基〔以RPMI 1640为基础培养基，并添 加了10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20μmol/L乙醇胺、5mg/L亚油酸、1g/L 牛血清蛋白、3mg/L抗坏血酸、2μg氢化可的松和12种微量元素〕，这一培养 基适合几种细胞的生长。

但是，研究中发现，无血清培养基中添加的蛋白成分价格太贵，且有的 成分，如牛血清蛋白，含有很多种杂质，给后期的分离纯化带来较大困难， 而且目前的新药审批对此方面的要求也越来越严格。因此，在商用无血清培 养基之后，科学家们又开始了对无蛋白培养基的研究，从动物细胞的培养基 中去掉蛋白成分。

在对细胞营养需求研究的基础上，美国专利5,045,468公开了一种适合 杂交瘤细胞生长的无蛋白培养基，该培养基通过添加亚硝基铁氰化物、EDTA、 二氧化硒或亚硒酸钠等化合物有效取代了培养基中的蛋白成分。美国专利 5,804,420公开了一种适合BHK细胞表达重组因子VIII的无蛋白培养基，其 中添加了嵌段式聚醚F68(Pluronic F-68)、硫酸铜、硫酸亚铁、EDTA、锰、 钼、硅、锂、铬等成分。另有报道，Jinyou Zhang等人成功地开发了一种适 合NSO细胞生长的无蛋白培养基，但由于其成分复杂、还包含了一种价格昂 贵、且化学成分未明确的商业混合脂，因此，不适用NSO细胞的大规模培养 及抗体生产。  

目前，在无蛋白培养基技术领域，以Gibco、Hyclone、JRH等为代表的 商业无血清、无蛋白培养基已相继问世，近年来众多研究所报道的培养基大 多采用这些商业无蛋白培养基，它们对某些细胞株具有良好的效果；但是， 它们同样也存在一些明显的缺点，将其用于某些研究和大规模细胞培养与抗 体生产过程会有不少困难，其主要问题是：第一，价格昂贵，只适合一部分 实验室小规模研究，不适合大规模细胞培养及抗体生产；第二，大多成分复 杂，并且添加了不确定的化学成分，给科研和生产过程带来困难；第三，有 些培养基虽能很好地支持细胞生长，但却使细胞表达产物的能力降低，甚至 丧失。

【发明内容】