[发明专利]一种改进的速效胰岛素前体的基因构建方法和性质测定

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和药学领域；更具体地，本发明涉及一种用于增加胰 岛素前体聚合性质的小肽，含有该小肽的胰岛素前体及其编码基因，以及它们 在胰岛素制备中的应用。

背景技术

近年来，糖尿病的发病率急剧上升，成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁 人类健康的重大疾病。现在全球糖尿病患者约有二亿三千三百万，预计2025年 将达到三亿，其中75％在印度、中国等发展中国家。

胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病以来，一直是无可替代的特效药。 但是，正常人体内胰岛素的分泌是受到血糖浓度调控的，一般是在进餐后30～60 分钟血胰岛素浓度达到峰值，4～5小时后恢复到基础浓度，这样能够保证血糖 浓度不因进餐而有大的波动。而常规胰岛素制剂在临床给药中不能模仿生理胰 岛素分泌的时效性，很难有效的控制饭后的血糖升高，还有给患者带来低血糖 的危险(Brange J.和Volund A.Insulin analogs with improved pharmacokinetic profiles.Adv Drug Deliv Rev 1999，35：307-335)，无论是在餐后立即注射胰岛 素，还是在餐前半小时注射胰岛素，都不能有效的模拟生理胰岛素的分泌曲线。 这是因为在中性溶液中，浓度高于100nmol/L时胰岛素以二聚体、六聚体的形 式存在，而其必须解离成单体后结合专一受体发挥生理功能。这种分子间的聚 合提高了胰岛素的稳定性，利于贮存和调节活性，确保能够精细、灵活地调控 血糖，但给胰岛素的吸收造成很大的障碍。胰岛素制剂常以六聚体形式存在， 注射后经过高倍的稀释由六聚体转为二聚体再转为单体胰岛素方能被吸收进 入血液循环。胰岛素在浓度为10^-3mol/L时是六聚体，在10^-5mol/L时为二聚体， 只有浓度为10^-8mol/L时才变成单体可以被皮下组织吸收，在肌肉或皮下这种高 倍的稀释是一个慢而长的过程，24小时只有50％的胰岛素被吸收。皮下注射胰 岛素制剂后，90～120分钟后血胰岛素达到比较低的峰值，之后又不能快速降低 (Dodson G.和Steiner D.The role of assembly in insulin’s biosynthesis.Curr Opin Struct Biol 1998，8：189-194.Brange J.Stability of Insulin.Kluwer Academic Pubs，1994)。

在中性溶液中，蛋白质浓度高于0.6mmol/L时仍然保持单体性质的胰岛素 类似物称为单体胰岛素。单体胰岛素在注射浓度为10^-3mol/L时进入血液可以直 接被皮下组织吸收。单体胰岛素是胰岛素发挥生物活性的功能单位，在给药处 无须经过高倍稀释即可被迅速吸收，且缩短了给药后药物作用的时程，故而获 得可用于临床的单体速效胰岛素是开发新一代治疗糖尿病药物的主要目标之 一。

虽然单体胰岛素具有很大的优越性，但是其前体在酵母或原核表达系统中 的表达量却很低。因此，本领域迫切需要开发新的单体胰岛素前体，使其在酵 母或原核表达系统中的表达量有大的提高，使得单体速效胰岛素更加具有产业 化的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽。

本发明的另一目的在于提供含有该小肽的胰岛素前体。

本发明的另一目的在于提供一种制备胰岛素(特别是单体胰岛素)的方 法。

在本发明的第一方面，提供一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽，所 述的小肽具有式(I)所示的氨基酸序列：

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃    (I)

其中，X₁或X₁₃独立地选自Lys或Arg；

X₂或X₅独立地选自Gly，Pro或Ala(优选Gly或Ala)；

X₃选自Glu或Asp；