[发明专利]同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的双重PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的检测方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl virus)病和根结线虫(Root-knotnematode)病是两种世界性病害。TY-1基因和Mi基因分别是番茄抗黄化曲叶病毒和根结线虫病的重要基因。

随着近年来番茄黄化曲叶病毒病和根结线虫病在国内的逐年加重，选育含有TY-1基因和Mi基因的番茄品种变得愈加迫切。

目前，文献：Zamir，D.，Ekstein-Michelson，I..，Zakay，Y.，Navot，N.，Zeidan，M.，Sarfatti，M.，Eshed，Y.，Harel，E.，Pleben，T.，Van-Oss，H.，Jedar，N.，Rabinowitch，H.D.and Czosnek，H..，1994，Mapping and introgression of aTomato yellow leaf curl virus tolerance gene，Ty-1.Theoretical and AppliedGenetics，88：141～146报道：发现了番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-1基因的CAPS标记，文献：Williamson，V.M.，Ho，J.Y.，Wu，F.F.，Miller，N.，and Kaloshian，I.，1994 A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in tomato.Theoretical and Applied Genetics，87，757-763报道，获得了番茄抗根结线虫病Mi基因的CAPS标记。

目前，常规的检测TY-1基因和Mi基因的方法，如Zamir，D文献公开的方法，但是，该方法存在一个明显的缺陷是，无法同时检测TY-1基因和Mi基因，因此，鉴定时间长、鉴定成本高，不能满足有关方面的需要。

发明内容

本发明的目的是建立一种同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的双重PCR方法，旨在节省鉴定时间、降低实验成本，加快番茄Ty-1基因和Mi基因的聚合育种进程。

本发明的方法，包括如下步骤：

(1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应：

95℃变性5min，然后94℃变性1min、61℃退火1min、72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，获得PCR产物，4℃保存；

所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为：

模板DNA             20ng/L

Ty-1引物            0.2umol/L

Mi引物              0.2umol/L

10×buffer          2ul/L

Mg²⁺                3.5mmol/L

dNTPs               250umol/L

Taq酶               0.2uL/L

所说的模板DNA指的是番茄DNA，制备方法如下：

1、取番茄嫩叶放入研钵中，加入液氮，研磨成粉末状，取40mg装入2mL的圆头离心管中。

2、加入700ul CTAB提取液，剧烈摇晃，使CTAB提取液与样品充分混合均匀。

(100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，3％CTAB，2％PVP，2％β-巯基乙醇)

3、65℃水浴1h。

4、置于4℃冰箱或室温冷却至15℃以下。

5、加入700μl 24∶1氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒混匀，抽提15min至溶液呈乳浊状，保证样品和氯仿充分混合。

6、12000rpm离心10min。

7、取上清液于1.5ml离心管中，加入等体积的预冷-20℃的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。

8、-20℃冰箱静置3h以上。

9、12000rpm离心10min，弃上清液。用70％乙醇洗涤沉淀2次。

10、吹干DNA，让乙醇挥发干净。

11、加200μL TE 65℃水浴溶解DNA。

(TE：10mmol/L Tris-Hcl和1mmol/LEDTA，PH＝8)

Ty-1引物序列：