[发明专利]一种病毒诱导的基因沉默系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒诱导的基因沉默系统及其应用。特别是一种以烟草花叶病毒TMV为载体的病毒诱导的基因沉默系统。

技术背景

植物分子生物学基本上依赖正向遗传学；即通过突变和克隆突变基因从而找到控制该表型的野生型基因序列。在过去的几年中，随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序的完成以及其它物种序列信息数据库的相继产生，意味着较传统正向遗传学更优越的研究基因功能的技术正应运而生。其中之一就是反向遗传学，它是通过改变某个基因或者序列的表达对其突变表型进行功能研究。T-DNA和转座子标签技术在产生突变体方面非常有效，但是不能研究存多基因家族的功能，很难达到基因组的饱和度，和由于插入的多样性常常造成对多个基因的共同失活。利用组织特异性启动子的反义RNA(antisense RNA，asRNA)和共抑制技术可以防止发育早期的抑制，但这都需要繁重的工作量、耗时，且存在结果的不可预测性。

1995年，人们发现了利用烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)携带与内源基因相同的序列会导致内源基因的转录后基因沉默(Kumagai et al.，1995)。这种载体是用番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)的(coat protein，CP)替代TMV-U1株系的CP。在TMV-U1的CP亚基因组启动子下游，表达需要沉默的基因的部分片段。重组TMV通过降解转录产物，定向下调特定的基因，因此人们很快认识到可以利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced genesilencing，VIGS)系统作为研究基因功能的工具(Baulcombe，1999)。VIGS系统对研究植物基因功能非常有效，特别是针对某些突变后可能造成胚死亡的基因和不易于转化的植物品种。VIGS作为功能基因组研究手段的另一个显著优势，是它可以在植物的一个世代时间范围内诱导特定基因的沉默表型，非常快捷。VIGS避免了对植株的转化，不依赖于转基因植物，而转基因对很多植物品种而言是非常困难的。通过VIGS载体携带基因家族的保守序列即可以达到沉默该家族全部或者主要成员的目的。相反，通过基因特异序列可以定向沉默基因家族中的特定成员。

目前利用烟草花叶病毒TMV作为载体建立的病毒诱导的基因沉默系统，通常是将目标基因片段插入到TMV外壳蛋白(coat protein，CP)或运动蛋白亚基因组启动子下游。目的基因与这些蛋白亚基因组转录物的拷贝数是一致的，都是单拷贝。目标基因片段在这些蛋白亚基因组转录时，被随之转录、翻译。转录产物被宿主植物的核酸内切酶所识别，并诱导序列特异性的对同源基因mRNA的降解，诱导基因沉默的产生。随着TMV粒子在叶片组织内的不断繁殖、浸染，被基因沉默的区域也随之扩大。不过使用该策略在诱导基因沉默的同时，还会在蛋白质水平上产生目的片段所编码的多肽，是否对后续TMV的包装、繁殖、继续浸染造成影响，继而影响沉默效果还值得商榷。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种以烟草花叶病毒为载体的病毒诱导的基因沉默系统。

本发明的目的之二在于提供该病毒诱导的基因沉默系统在目标基因沉默中的应用

为达到上述目的，本发明的构思是：病毒诱导的基因沉默系统是一种由RNA介导的转录后基因沉默，这种沉默的产生并不需要病毒携带的目标基因在蛋白水平的表达，它只需要目标基因在转录水平上作为一种外源核酸片段被宿主植物的核酸内切酶所识别，并诱导序列特异性的对同源基因mRNA的降解。另外，经典的病毒学研究表明，TMV在合成自身亚基因组的过程中会形成RNA的双链阶段，而这些亚基因组都包含了病毒基因组的3’非翻译区(untraslated region，UTR)。因此，利用以上原理，将目标基因片段插入TMV cDNA的CP终止密码子与3’UTR之间，除了不会在蛋白质水平上产生新的多肽外，目的基因转录产物不再是单拷贝，而是远远高于现有TMV VIGS转录产物的拷贝数，基因沉默效率也就更高。

根据上述构思，本发明采用如下技术方案：

一种病毒诱导的基因沉默系统，以烟草花叶病毒TMV为载体，其特征在于该系统是将目标基因DNA片段插入到烟草花叶病毒TMV外壳蛋白CP的终止密码子与3’非翻译区之间，并在烟草花叶病毒TMV外壳蛋白CP的终止密码子与3’非翻译区之间引入了多克隆限制性内切酶切位点，用于目标基因DNA片段的插入；所述的目标基因DNA片段不大于1kb。