[发明专利]一种弓形虫PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学及实验动物寄生虫质量控制技术领域，尤其涉及弓形虫PCR检测方法。

背景技术

现行国家标准中的弓形虫检测依仗血清学检测，然而血清学检测存在无法避免的滞后性以及难以检测环境中的病原体。

在实验动物质量控制新国标修订稿中列举了弓形虫检测的PCR方法。该方法是对原有血清学方法(IHA、IFA、ELISA等)的有效补充。但是仍需要处死动物，并且检测方法相对繁琐。

由于PCR是以指数方式扩增，极微量的DNA污染都可能造成假阳性结果，因此反应体系的干净程度是绝对重要的。现有技术中，需要自行加入各种PCR反应组分，容易发生核酸污染，干扰检测结果。参照修订稿中的操作流程，需要在PCR操作时分7次加入PCR反应组分以及反应过后电泳前的上样缓冲液，共8次需要移取试剂加入PCR反应管。耗时费力，且人为操作不慎，操作地点设备(如超净工作台失效)，甚至PCR操作区域布局不当，都使反应体系受污染的机率大大增加，会直接改变PCR结果，影响诊断。

另外，在该修订稿中，仍需要处死动物采取腹水、其他组织或采取大量血液(0.2毫升已经超过小鼠最大安全采血量)作为样品，每检测一只动物就必须处死或者采血造成动物伤害。

因此，本领域迫切需要提供一种简便、有效的实验动物弓形虫PCR检测方法，并且无需处死动物。

发明内容

本发明旨在提供一种实验动物弓形虫PCR检测方法。

在本发明中，提供了一种弓形虫PCR检测方法，所述的检测方法包括步骤：

(1)将引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；

(2)将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和

(3)将PCR产物进行电泳检测；

所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和/或粪便的核酸。

在另一优选例中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的缓冲液是10X PCR缓冲液，其中含有氯化钾，Tris-HCl，和Triton X-100。

在另一优选例中，所述的10X PCR缓冲液的配方是500m M氯化钾，100mM Tris-HCl，1v/v％Triton X-100，和双蒸水。

在另一优选例中，PCR产物电泳前的上样缓冲液是10X上样缓冲液，其中含有丙三醇，和GelRed^TM。

在另一优选例中，所述的10X上样缓冲液的配方是50v/v％丙三醇，和0.05v/v％GelRed^TM。

在另一优选例中，所述的Taq DNA聚合酶为红色。

在另一优选例中，所述的哺乳动物选自灵长类动物、猫科动物、犬科动物、或啮齿类动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物选自猴子、猪、猫、犬、大鼠、或小鼠。

在另一优选例中，所述的样品还包括阳性对照品和阴性对照品。

据此，本发明提供了一种简便、有效的实验动物弓形虫PCR检测方法，并且无需处死动物。

附图说明

图1显示了实施例1中的检测电泳图；其中A显示的是DL2000标记物的电泳结果，B显示的是标准阳性片段的电泳结果。

具体实施方式

发明人在实践中发现可以通过检测实验动物的排泄物，如尿液和/或粪便，用PCR的方法检测弓形虫是否存在，并且所述的用于检测的PCR试剂是一次性加入，避免了由于操作步骤繁多而可能造成无法准确检测的后果。

如本文所用，“PCR”是指聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学技术。

本发明中所使用的聚合酶稳定剂是上海赛百盛基因技术有限公司的产品。

Tris是指三羟甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane)。

Triton X-100是指曲拉通X100(Amresco)。