[发明专利]一种癌症早期转移的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种癌症早期转移的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。

【背景技术】

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，“认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是：1.不能做到真正的早期诊断；2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实：一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)或突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。

多年前，研究人员已发现癌症转移患者血液中UCP的浓度要比正常人高得多，但一直不知道它们在细胞当中的功能及癌细胞发生变化的相关性，韩国的研究人员发现UCP可以调节抑制癌细胞的VHL蛋白，他们利用免疫荧光技术和患肿瘤的实验鼠，发现与发生肝癌有关的UCP影响可抑制癌细胞增殖的蛋白VHL的分解，在癌组织周边形成血管，提供癌细胞增殖所必需的氧和营养，使癌细胞增殖。以前在小鼠实验中观察到VHL蛋白的抑制癌细胞增殖的功能，但对它的抗癌功能存在怀疑。最新的研究发现，VHL抑制癌细胞增殖功能在人类癌培养细胞中无效是因为UCP的拮抗作用。研究表明在各种原发性癌转移癌细胞中的UCP都过度的表达，这在癌症早期基因诊断癌细胞是否扩散、转移的靶标开发有非常重要的意义。揭示了UCP蛋白当癌细胞在血液中扩散时引起的分子拮抗事件。VHL蛋白在癌细胞周围形成保护盾，阻止癌细胞扩散形成继发性肿瘤，同时，血液中的UCP蛋白会攻击此蛋白，分解VHL蛋白，为癌细胞的扩散提供便捷。UCP蛋白在许多癌症中表达过度。他作于癌症转移的基因诊断早期指标有非常重要的临床意义。

目前对UCP基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。根据现有的文献资料UCP基因的检测试剂盒及相关技术未见报道。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。