[发明专利]一种甜瓜杂交种的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物品种的鉴定方法，具体涉及利用分子标记(SCAR-SequenceCharacterized Amplified Regions)技术鉴定甜瓜(Cucumis melo L.)杂交种的纯度及真实性的方法。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是我国重要的经济作物之一。随着甜瓜产业的迅速发展，目前甜瓜杂交一代品种已广泛应用于生产，但是在人工杂交制种过程中，由于隔离不严或人工去雄不及时、不彻底等原因，常混有母本自交系种子或由其它不明来源甜瓜花粉所造成种子的生物性混杂；同时在种子流通过程中，也可能会出现外来种子混入或人为掺假造成的机械混杂，不仅给生产带来了重大损失，也制约了甜瓜杂交种的推广应用。此外，个别不法分子为牟取暴利，甚至盗用育种者的亲本材料繁种销售，大大侵害了育种单位和育种者的合法知识产权。因此，寻找一种快速有效地鉴定甜瓜杂交品种/组合真实性和纯度的方法十分必要。

传统的大田形态鉴定法仍是目前最常用的方法。该法鉴定结果虽较为可靠，但周期长，花费大，占用土地，受季节限制，秋季鉴定往往要利用温室或到海南等气候适宜的地方进行，而且很多性状的表现易受栽培措施及环境因子的影响；鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性；随着大量新品种的不断涌现，又增加了形态鉴定的难度。因此该法不能有效地起到“打假”的作用。

九十年代，我国不少学者曾利用蛋白质、同工酶电泳技术对甜瓜杂交种进行鉴定。该法可在室内进行，易于早期识别。但是同工酶和蛋白质都是基因表达的产物，都是对基因的间接反应，多态位点有限，且易受发育阶段和表达器官的影响，条件要求严格，不易控制。再者，它们的提取过程复杂，尤其是同工酶，需要低温操作，耗时长，成分数量不稳定，难以提取，不易对大量样本进行分析。

随着分子生物学的飞速发展，各种DNA分子标记技术也相应问世。美国科学家Williams等建立的RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是发展较早的分子标记技术之一，由于该技术具有操作简便，速度快，费用低等优点，特别是它可以对无任何分子生物学基础的物种展开研究，因此倍受青睐。闫鹏等从100条RAPD引物中筛选到在2个甜瓜杂种一代及其亲本间呈现多态性的特异引物，可用于其纯度鉴定(《甘肃农业大学学报》，2007，42(2)，43～46)。乐锦华等利用20个随机引物对厚皮甜瓜8个亲本与4个杂交种进行RAPD分析，发现10个引物的扩增谱带具有多态性，亲本具有各自的特异谱带，绝大部分F₁的谱带是双亲互补带，可用于亲缘关系及纯度的鉴定(《果树科学》，2000，17(4)，295～299)。刘富中等(2002)从80个随机引物中选出5个可鉴定3个甜瓜杂交种的纯度，其中OPM17可同时用于3个甜瓜杂种的纯度鉴定(《中国蔬菜》，2002(5)，7～9)。由于RAPD技术稳定性、重复性较差，鉴定结果的准确度会大受影响。再者，利用分子标记技术鉴定甜瓜杂交种的真伪目前还处于空白阶段。

发明内容

本发明使用了RAPD-SCAR分子标记及相关分子生物学技术，目的旨在建立一套快速、准确地鉴定甜瓜杂交种纯度及真伪的新方法。

本发明公开了一种甜瓜(Cucumis melo L.)杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物GGGATATCGGAAGGT和GGGATATCGGGAATA对样本的基因组DNA进行PCR扩增。

上述甜瓜(Cucumis melo L.)杂交种为‘东方蜜2号’。上述特异双引物为针对甜瓜(Cucumis melo L.)杂交种‘东方蜜2号’的特异RAPD标记序列设计的。较佳的，上述样本的基因组DNA为植物幼苗的基因组DNA。

上述鉴定方法还包括：根据PCR后439bp的DNA条带的有无对甜瓜(Cucumis melo L.)杂交种的纯度及真实性进行鉴定。

本发明的鉴定方法中，特异性引物通过下列方法筛选获得：采用200条RAPD引物对甜瓜(Cucumis melo L.)杂交一代品种‘东方蜜2号’及其亲本和7个同母异父的杂交组合进行一系列的分子生物学技术处理和实验分析，并筛选到‘东方蜜2号’的特异RAPD标记，对RAPD标记进行克隆和测序，根据测序结果设计并合成特异性PCR(PolymeraseChain Reaction)引物，并对该引物的特异性进行验证。最后利用该SCAR标记对甜瓜(Cucumis melo L.)杂交种‘东方蜜2号’进行真伪及纯度鉴定。

筛选具体过程如下：