[发明专利]乙型肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于定量检测乙型肝炎病毒表面抗体的试剂盒。

背景技术：

众所周知，乙肝病毒是严重威胁我国人民身体健康的病原体微生物之一，人群普遍易感。我国是乙型肝炎的高发区，人群总感染率高达60％，全国乙型肝炎表面抗原携带者至少有1.2亿，其中约10％最终转化为各种慢性肝病，包括慢性肝炎、肝硬化和肝癌。成年人感染HBV后，90％～95％为自限性，5％～10％可成为持续性感染或慢性化，输血后乙型肝炎中的50％将慢性化。围产期及新生儿被HBV感染后，如果没有进行疫苗阻断，85％～90％可以成为无症状的HBsAg携带者。

普遍认为乙型肝炎表面抗体是乙肝病毒的唯一保护性抗体，它的存在是HBV感染被清除，身体产生对乙肝病毒免疫力的标志。另外，随着乙肝疫苗的普遍使用，对于疫苗的使用效果也要由身体是否产生表面抗体来判断。因此对于乙型肝炎表面抗体的检测，能够提示乙肝病情的恢复和治疗情况，判断注射疫苗后身体对病毒的免疫情况。

但长期以来，国产的HBV感染标志物检测试剂一直采用方法学上比较落后的酶联免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)分析试剂，更先进的发光免疫检测试剂则主要依赖进口；尽管进口的发光免疫检测方法在灵敏性、特异性、有效期和测量范围方面均有优势，但其昂贵的价格却不易被国内大多数用户所承受。因而市场上急需优质而价廉的国产诊断试剂。

发明内容：

本发明中缩写的含义：

HBsAg：乙型肝炎表面抗原；抗-HBs：乙型肝炎表面抗体；DTTA-Eu：一种铕离子螯合物N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠；β-NTA：β-萘酰三氟丙酮；Sephacryl S-200：一种凝胶层析柱填料聚丙烯酰胺葡聚糖S-200；Triton X-100：壬-(乙二醇)苯辛基醚；TOPO：三辛基氧化膦；Ag：抗原；Ab：抗体，Ab-Eu：铕标记抗体。

本法发明的目的是提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好、无污染的乙型肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒。主要解决进口发光免疫检测方法成本过高的技术问题。

为实现上述目的，本发明通过以下方案实施：

乙型肝炎病毒表面抗体定量检测诊断试剂盒，试剂盒由乙型肝炎表面抗体校准品、纯化HBsAg包被反应板、铕标记纯化HBsAg、铕标记稀释液、荧光增强液、浓缩洗液组成。

所述纯化HBsAg包被板的制备：将纯化HBsAg以磷酸盐缓冲液稀释适当比例(0.75-6μg/ml)后加入微孔板内，100μl每孔，过夜后洗涤、封闭、干燥，而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。

所述纯化HBsAg铕标记物的制备：：将纯化HBsAg对碳酸盐缓冲液透析后与DTTA-Eu以1∶5的比例混合，静置18小时后经Sephacryl S-200分离柱分离DTTA-Eu与Ag-Eu，获得铕标记过的纯化HBsAg。

所述乙型肝炎表面抗体校准品的制备：以中国药品生物制品检定所国家标准品2mIU/ml、5mIU/ml、10mIU/ml标定抗-HBs羊血清，然后稀释成含量分别为5mIU/ml、10mIU/ml、40mIU/ml、160mIU/ml、640mIU/ml的校准品，以1ml/瓶装量分装即可。

所述荧光增强液的配制，以无水乙醇溶解β-NTA、TOPO，再加邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，40℃溶解后，加入乙酸、Triton X-100，调PH值至3.2，并定容。

所述使用方法包括以下乙型肝炎病毒表面抗体测定步骤：

1.试剂的准备

(1)洗涤液：将40mL浓缩洗液和960mL去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗涤液备用。

(2)铕标记物：准确吸取0.3ml去离子水充分溶解标记物冻干品，并充分混匀，使用前一小时内用铕标记稀释液按1∶50倍稀释并一次用完(使用一次性的塑料容器来配制)。

2.将试剂及所需数量的微孔反应条置室温(室温专指20-25℃范围，下同)平衡。

3.吸取100ul抗-HBs校准品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片。

4.微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育40分钟。

5.在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液400ul，再吸干各孔，重复以上洗涤4次，最后一次将微孔反应条拍干。

6.每孔中加入100ul铕标记物工作液，并加贴封片。

7.微孔反应条在室温条件下，用振荡仪缓慢振摇孵育40分钟。