[发明专利]重组长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白，具体涉及重组长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法。

背景技术

糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，已成为现代社会严重危害人类健康与生命的主要疾 病。根据世界卫生组织(WHO)提供的数据，发达国家糖尿病患病率已高达5％-10％，在我国 则为3％左右；到2030年，全世界糖尿病患者人数将比2000年翻一番。其中2型糖尿病患 者人数目前约占所有糖尿病患者人数的90％以上。

胰高血糖素样肽-1(glucagon.like peptide.1GLP—1)可以与GLP-1受体相结合， 通过多种作用控制血糖，包括刺激胰岛素分泌、同时抑制胰高血糖素和胃排空，但是不会 产生低血糖，对II型糖尿病的治疗具有较好的效果。天然胰高血糖素样肽-1在体内很快被 DPP-IV降解，半衰期只有2-3分钟，在给药上具有很大的困难。

肠促胰岛素类似物(exendin-4)最初由毒蜥属动物唾液中分离，是由基因exendin-4 表达产生，可激活人体内GLP-1受体，可以通过促进胰岛素分泌和细胞再生、抑制食物摄 入而降低血糖。但它不是DIP-IV的底物，因而具有较长的半衰期和较强的生物活性。 exendin-4注射给药后，能够模拟调控机体胰岛素的激素在体内发挥作用，从而达到控制血 糖的效果。exendin-4一天注射两次，优点在于不需要根据糖化血红蛋白(HbAlc)或血糖 水平来调整剂量，在早餐和晚餐前给予固定剂量即可，从而减少患者频繁监测血糖的不便。 HGS公司的Albugon，它是GLP-1和人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的融合体， 它在猴子体内的半衰期为3天，目前已进入临床II期。

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中的蛋白质总量的一半。白 蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维 持血压的一个重要因素。人血清白蛋白是一种球状非糖基化的，分子量为65Kd的蛋白质。 人血清白蛋白的基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区，经RNA加 工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白在经过高尔基体的 转化加工，去除分泌信号而分泌到细胞外。人血清白蛋白有35个半胱氨酸，构成17个二 硫键的单体(Brown JR，The structure，functional and application of human albumin， Pergamon，NY1977)。人血清白蛋白具有多种多态形及30种不同的遗传分子(Weikamp， CR，human genomic Annual，37：219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三维结构已经由 X光衍射法测定(Carter，Science，244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液种的 主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。综上所述，人血清 白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高的剂量 使用。

目前用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白 (rHSA)的生产专利已经公开，EP330451和EP361991。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法。

本发明中的长效胰高血糖素样肽类似物为将exendin-4和人血清白蛋白通过基因工程 的方法融合在一起的融合蛋白，融合蛋白分子既保持exendin-4蛋白的生物学功能，又含 有HSA稳定的惰性性质，极大的延长了exendin-4的半衰期。在临床使用中可减少注射给 药次数，减轻患者的痛苦，提高疗效并降低医疗费用。

以往不同基因融合表达中，在考虑两个蛋白生物学活性上，两个基因之间往往需要连接 肽(linker)连接，而连接肽在临床治疗中可能造成高的免疫原性。本发明在研究exendin-4 蛋白和人血清白蛋白构象和活性中心后，充分利用两个不同蛋白N端和C端的序列特征， 使两个基因直接相连融合表达，避免了免疫原性的担忧，同时保留了exendin-4的降糖活 性。本发明在获得了表达长效胰高血糖素样肽类似物的基因工程菌的基础上，又对其发酵 和纯化工艺进行了选择及优化，在保证产物活性的基础上，进一步提高了蛋白表达效率及 纯化产物得率。