[发明专利]大熊猫西氏蛔虫抗原的制备及其应用

权利要求书

1.大熊猫西氏蛔虫抗原，其特征在于其抗原基因为Bs-Ag1基因，Bs-Ag1基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。

2.权利要求1所述大熊猫西氏蛔虫抗原的制备方法，按照下述步骤制备：

(1)以大熊猫蛔虫成虫或二期幼虫为模板，用RNA试剂盒法提取大熊猫蛔虫总RNA；

(2)根据猪蛔虫的抗原基因序列设计大熊猫蛔虫Bs-Ag1基因引物，所述引物

序列分别含BAMHI酶切位点和HindIII酶切位点：

上游引物：5’-CGCGGATCCCAAGGACCTCAAGGACCACCAC-3’

下游引物：5’-CCCAAGCTTCTAGCCTTGCATCTCTTTTTG-3’；

(3)将大熊猫总RNA逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出目的产物Bs-Ag1基因；

(4)将回收纯化的目的产物直接与pMD18-T载体连接后，转化至受体细胞大肠杆菌K-12的衍生菌DH5α感受态细菌，经含有氨苄青霉素的平板筛选培养，培养于3mlLB培养基中，培养14-16h后，取2μl培养的重组克隆菌液为模板，经过菌落PCR鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性重组克隆，小规模扩大培养后，进行测序。

3.根据权利要求2所述的大熊猫西氏蛔虫抗原的制备方法，其特征在于：构建大熊猫西氏蛔虫抗原重组蛋白的原核表达载体，进行重组质粒PET28a(+)-Bs-Ag1的构建，包括如下步骤：

(1)用HindIII及BamHI消化测序正确的阳性克隆质粒，将其目的片段与用相同酶消化的PET28a(+)表达载体连接；

(2)诱导表达和重组蛋白的纯化：将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，根据表达的观察结果，进行蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；将所得细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置1h，使包涵体蛋白完全溶解；将重组蛋白rBs-Ag1于4℃条件下在含8mol/L尿素的PBS中溶解，将溶液于4℃保存。

4.根据权利要求1所述的大熊猫西氏蛔虫抗原用于制备检测大熊猫蛔虫感染的ELISA试剂盒的应用。