[发明专利]一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法。

背景技术

血管紧张素转化酶(ACE)对血压调节起着重要的作用，在人体的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)中，ACE以血管紧张素I和舒缓激肽为底物，导致血管收缩，引起血压升高。

血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)是现今治疗高血压与心力衰竭的主要有效药物，化学合成的ACE抑制剂在临床使用时暴露了诸多缺陷，如：作用时间短，血压易反弹，对人体内多个部位造成损伤等。源于食物蛋白质的ACE抑制剂-血管紧张素转换酶抑制肽因其食用安全性高，无毒副作用等优点引起了人们的广泛关注。

目前已有人从沙丁鱼、金枪鱼、小麦、玉米、大豆、酸奶、清酒等食品中分离出具有ACE抑制活性的降压肽并显示出了良好的应用前景。

我国是世界最大的罗非鱼生产国，随着鲜鱼片、冻鱼片和条冻鱼出口量的逐年上升，由此产生的大量鱼皮等下脚料需要处理。这些下脚料若不加以有效的利用，不仅会造成极大的浪费，而且还会造成环境的污染。目前，国外对鱼类胶原蛋白的研究较为深入，有关鱼皮胶原蛋白的研究也有不少报道，但是，对罗非鱼鱼皮胶原蛋白的有关研究，既不系统，也缺乏深度。

罗非鱼鱼皮含有丰富的胶原蛋白，如果能够对其进行充分利用，通过酶法加工淡水鱼胶原蛋白获得抑制ACE的活性肽，对促进人们生活质量的提高将会收到很好的经济效益与社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种源于鱼皮的ACE抑制肽的分离纯化技术，获得鱼皮中具有降血压活性的多肽片段。

本发明是这样来实现的，其方法步骤为：

1、预处理：清洗后的鱼皮经脱脂后，依次用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1hr。

2、水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45℃条件下，用10倍体积的蒸馏水恒温匀浆12hr后，抽滤提取上清液。

3、酶解：在一定条件下，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，比较两种酶的酶解效果，并确定最佳酶解条件。

4、灭酶：采用100℃，20min灭酶。

5、脱苦、脱色、脱味：分别采用活性炭和复合脱色剂(3g/L的活性炭酵母和环糊精等混合而成)对酶解液进行脱苦、脱色、脱味处理，比较两种方法的效果。

6、过滤：酶解液经脱苦、脱色、脱味处理后，再经4000r/min离心过滤获得清液。

7、离子交换：取一定体积的超滤液在常温下以8倍柱体积/h的流速通过001*7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，收集流出液，再将脱阳离子后的水解液以8倍柱体积/h的流速通过201*7(717)强碱性I型阴离子交换树脂，收集流出液。

8、浓缩：使用旋转蒸发仪，浓缩温度为50℃，蒸发溶液至粘稠状。

9、超滤：选用中空纤维材料，超滤设备的工作压力为28psi，膜渗透通量为9.98LHM，超滤处理时间为40min，进料温度为29℃，料液pH值为6.7。

10、凝胶色谱：收集超滤液进入凝胶色谱进行进一步分离纯化，分离介质为SephadexG-15，色谱柱(1.6×60cm)，柱层析条件：上样量：1.5ml；流速：0.8ml/min；洗脱剂：蒸馏水；检测波长：220nm。

11、测定ACE的抑制率：参照Nakamura等(1995)改进的方法，根据反应体系的大小、乙酸乙酯萃取量、离心时间等具体情况进行了一定研究和修改。分别测定每个组分峰的半数抑制浓度(IC₅₀)，即所测样品对ACE抑制率达50％时所对应的样品浓度。

据表1将各试剂加入到试管中，在37℃水浴中反应30min，反应结束后马上加入1moL/LHCI以终止反应(样品c需提前加入HCl)，静止5min后，于各试管中加入乙酸乙酯(冷)2.0mL，旋涡混合2min后离心10min(4000r/min)，吸取1.5mL乙酸乙酯于另一试管中，放入烘箱中，120℃挥发溶剂30min，冷却后加入去离子水3mL，旋涡混合30sec静止15min后在228nm下测定其吸光值。

表1ACE体外检测抑制率的方法(ul)