[发明专利]一种诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法，属于生物医学领域。

技术背景：

抗生素的大量使用已使不少病原菌产生了抗药性，给一些疾病的治疗带来了困难。昆虫、蜘蛛、虾蟹等节肢动物体抗菌肽对革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌均有高效广谱的杀伤作用，可以杀死已产生耐药性的病原菌突变种，不会诱导抗药菌株的出现。抗菌肽不仅能作用于细菌、病毒以及其他一些原核生物，对肿瘤治疗也能起到一定的作用。抗菌肽极有可能成为抗菌素、抗病毒素以及抗肿瘤药的新来源。

昆虫、蜘蛛、虾蟹等节肢动物体体内的抗菌物质主要是通过各种体外诱导之后，昆虫、蜘蛛、虾蟹等节肢动物体内的一些组织(如脂肪体等)将合成抗菌物质并运输到血淋巴中，从而形成昆虫特有的防御系统。未经体外诱导的节肢动物体内的抗菌肽抗菌活性低、数量少。寻找高效简单的体外诱导及抗菌肽提取方法，使其能从昆虫体内提取更多、抗菌活性更高的抗菌物质，成为技术上亟待解决的问题。

蜘蛛是仅次于昆虫的一大类无脊椎动物，数量多，分布广，能在各种环境中生存，具有很强的抗逆能力。对蜘蛛抗菌物质的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有广阔的应用前景。目前，国内外关于蜘蛛抗菌物质的研究报道很少，仅见Acanthoscurria gomesiana(一种捕鸟蛛)抗菌肽的分离、纯化及分子克隆等方面研究。

发明内容

本发明的目的时提出一种简便、高效的诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法。

本发明是这样实现的，操作过程为：

1、紫外线照射诱导：将角类肥蛛放于培养皿中，于20w紫外灯下距离1米处照射0.5-3h，其中以1-1.5h为最好，然后在正常条件下继续饲养。

2、诱导后蜘蛛的饲养：将经紫外线照射的蜘蛛单头饲养于玻璃指管(长度×直径＝12cm×4cm)内，管底垫有吸足水的海绵供蜘蛛饮水，用棉花塞封口，然后将装有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培养箱中，光照周期为12∶12(Light∶Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蝇(Drosophila sp.)和摇蚊(Tendipes sp.)成虫。

3、蜘蛛血淋巴的提取：

采用组织匀浆法：将诱导后的蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml离心管中，加入预冷的无菌水匀浆(当外界温度较高时，还需加入一些巯基乙醇防止抗菌物质黑化)，匀浆液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除上层脂肪，收集上清液置-20℃冰箱保存。

4、从紫外线照射后蜘蛛提取抗菌活性物质的时间

将经紫外线照射诱导的角类肥蛛分别于诱导后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h和120h时，用组织匀浆法采集血淋巴。以支气管败血博氏菌为指示菌，用涂平板打孔法，测定了各个时间角类肥蛛免疫血淋巴的抗菌活性。每处理设10次重复。

用紫外线照射诱导后，蜘蛛免疫血淋巴的抗菌活性上升很快，诱导后25-70h时抗菌活性可达70％，以诱导后60h时抗菌活性最高。随后抑菌活性随时间的增加开始缓慢下降，至120h时，仍然保持一定的抗菌活性。(见表1)

表1经紫外线照射诱导后角类肥蛛血淋巴粗提液的抗菌活性随时间的变化趋势

蜘蛛血淋巴抑菌活性的测定：采用涂平板打孔法。将处于对数生长期的细菌配成10⁶cfu/ml浓度的菌液，用L型玻璃棒均匀涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花状打孔，孔径为0.5cm。每孔加血淋巴粗提液15μl。将平板于4℃倒置2h后，于3℃培养16-18h，测量记录抗菌活性。抗菌活性的大小用抑菌圈直径来表示(抑菌圈直径＝总直径-孔的直径)。

采用三种方法(紫外线照射、大肠杆菌注射法和饥饿法)诱导角类肥蛛，然后以涂平板打孔法(Hultmark，1984)测定蜘蛛血淋巴对指示菌的抗菌活性，比较3种诱导方法的效果。

经过诱导的角类肥蛛血淋巴粗提液对支气管败血博氏菌和猪葡萄球菌两种菌的抗菌活性，均显著高于未经诱导的血淋巴粗提液的抗菌活性(表1)。其中，紫外线照射诱导的蜘蛛血淋巴粗提液对支气管败血博氏菌的抑菌效果显著高于注射诱导法，对猪葡萄球菌的效果也大于细菌注射法，但差异没有达到显著水平。在三种诱导方法中，对2种指示菌的抑菌效果均以紫外线照射诱导抑菌圈的直径最大，效果最好。

表1不同方法诱导角类肥蛛血淋巴粗提液的抑菌效果