[发明专利]一种双色荧光报告载体的构建方法和应用

权利要求书

1. 一种双色荧光报告载体，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2. 一种用于制备权利要求1所述的双色荧光报告载体的方法，它包括下列步骤：

A.衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin的构建：PCR扩增出带有启动子和转录终止信号的氨苄基因，此序列是以pUC18为模板利用KOD DNA聚合酶扩增出的pUC18中从1566到2617的一段DNA序列，将此序列以平末端的方式插入到pEGFP-N1载体的Afl II酶切位点，由此衍生出的质粒为pEGFP-N1-Ampicillin；

B.衍生质粒pMD18-EGFP的构建：PCR扩增出在EGFP基因5’端含有StuI-SalI酶切位点的产物，然后将此产物连接到pMD18-T vector中，为pMD18-EGFP；

C.衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建：利用PCR扩增出pEGFP-N1中从3424到3860间的一段序列，该序列的两边分别含有Pst I和Hind III酶切位点，此PCR产物经Pst I和Hind III双酶切后连接到上述衍生质粒pMD18-EGFP相应位点，由此生成的质粒为pMD18-EGFP-polyA；

D.衍生质粒pEGFP/EGFP的构建：用Dra II和Stu I双酶切上述衍生质粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1,188bp的片断，将此片段亚克隆进上述已经制备好的衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin相应位置处，由此衍生出的质粒为pEGFP/EGFP；

E.目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建：用Nhe I和Not I切下质粒pDsRed-Monomer-N1从多克隆位点到DsRed-Monomer基因末尾处的一段775bp的片断，将此片段亚克隆进上述已经构建好的衍生质粒pEGFP/EGFP的相应位点，由此得到双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，用此载体转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，用于其增殖和保藏；

F.双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的一种衍生双色荧光载体pEGFP/DsRed-HBx的制备方法，步骤如下：

a.HBx基因片断的PCR扩增制备：利用PCR扩增出在HBx基因两边分别含有NotI和Xba I酶切位点的片断；

b.Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得：为了获得Xba I消化的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，将双色荧光报告载体pEGFP/DsRed转化到ER2925菌株中，然后从ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed质粒；

c.pEGFP/DsRed-HBx克隆的构建：用Not I和Xba I分别双酶切HBx基因的PCR产物和从ER2925菌株中抽提出来的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，将HBx基因产物连接到pEGFP/DsRed的相应位置，转化ER2925菌株，得到双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx。

3. 一种双色荧光报告载体在高通量筛选且定量siRNA效率中的应用。