[发明专利]应用紫外线诱变甘蓝型油菜离体小孢子和突变体筛选方法

权利要求书

1.一种应用紫外线诱变甘蓝型油菜离体小孢子和突变体的筛选方法，其特征在于，用蔗糖水溶液分离甘蓝型油菜小孢子，将小孢子悬浮在添加秋水仙碱的改良的NLN培养基上进行紫外线照射及染色体加倍，将染色体加倍后的小孢子转入改良NLN培养基上诱导成胚状体；将再生的胚状体转入B5培养基诱导成双单倍体植株，将所述的植株移栽至田间进行鉴定，筛选突变体，步骤如下：

(1)用含13％蔗糖的水溶液分离甘蓝型油菜单核晚期的小孢子；

(2)将分离出的小孢子按120000/mL密度悬浮在添加秋水仙碱的改良NLN液体培养基上，置于超净台上用紫外灯照射95-100秒；

(3)将紫外线处理过的小孢子置于32℃的培养箱中暗培养2天，使其染色体加倍，然后再于25℃的培养室中进行暗培养，诱导出胚状体；

(4)将步骤(3)诱导的胚状体转入附加2％蔗糖的B5固体培养基，于25℃，光照强度3000LUX，12小时/天光照下发芽，得到小植株或畸形小植株；

(5)将步骤(4)的小植株或畸形小植株切除根后，转入附加0.12mg/L多效唑，2％蔗糖的B5固体壮苗培养基上，于25℃培养成壮苗；

(6)将步骤(5)的壮苗从试管中直接移栽到田间；

(7)在田间观察植株的形态特征，选择变异体；

(8)在花期将所述的双单倍体植株套袋自交，于成熟期收获自交种子，检测种子的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙含量，进一步筛选品质性状变异体；

(9)将产生的形态变异体和品质性状变异体的种子于油菜种植季节播种到田间，进一步鉴定其遗传稳定性；

其中步骤(2)所述的改良的NLN培养基的组分如下：

KNO₃ 125mg/L，MgSO₄·7H₂O 125mg/L，KH₂PO₄ 125mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 750mg/L，Na₂EDTA37.3mg/L，FeSO₄.7H₂O 27.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 25mg/L；KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 10mg/L，2nSO₄·4H₂O10mg/L，Na₂M₀O₄·2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，维生素B₁0.5mg/L，维生素B₆0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L，甘氨酸5.0mg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酰胺800mg/L，丝氨酸100mg/L；蔗糖130g/L；

步骤(2)所述的紫外灯照射小孢子的剂量的参数是：功率30W，波长253.7nm，被照射的小孢子距紫外灯15cm；

步骤(2)所述的秋水仙碱添加量为70mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的胚状体是鱼雷后期至子叶初期的胚状体。