[发明专利]构建基因重组运动发酵单胞菌应用于乙醇发酵

说明书

技术领域

本发明涉及纤维素类物质向燃料和化学物质的生物转化，特别涉及提高运动发酵单胞菌对 多种逆境的抗性、提高其发酵温度、降低其生长的营养需求，同时还涉及运动发酵单胞菌利用 戊糖生产乙醇。

背景技术

本发明涉及对运动发酵单胞菌进行基因工程改造的方法，用于增加其对多种逆境的抗性、 提高其发酵温度、降低其生长的营养需求，同时还使运动发酵单胞菌能利用戊糖生产乙醇。

在高温条件下，细胞的分解代谢能力增强，发酵时间缩短，生产能力提高；氧溶解度降低； 发酵液的粘度降低，搅拌所需动力减少；发酵料液在灭菌后冷至适当发酵温度所需的时间减少。 高温发酵可以利用发酵反应所产生的热量，省去传统发酵所需要的大量冷却水；高温发酵有利 于提高发酵效率和乙醇的分离。

每一种生物有一个耐热极限温度域值---超过这一温度，生物就将死亡。生物的耐热温度域 值可能由一系列的条件所决定：例如细胞膜的组成和参与生命基本活动的酶系的稳定性。将生 物置于亚致死热状态，可以使其获得额外的稳定的热耐受力。这种“热耐受”被认为来源于亚致死 高温诱导产生的热休克蛋白(HSP)。针对提高的温度，所有的生物均能特异性地诱导表达一系列 新的热休克蛋白HSPs。HSPs的功能特点来源于其分子伴侣样作用一促进蛋白的折叠、预防性地 抑制其它蛋白的变性、介导蛋白的降解。除了用热压力以外，许多HSP能用其它方式进行诱导 产生，包括：用亚砷酸盐、乙醇、重金属、氨基酸类似物(Lee，Y.R.，et al.，Plant Physio.110：240-48， 1996)。正常细胞也可以在无压力(而不是因为热压力)状态下，产生与HSP保守序列相关的同类物。 HSP提供逆境抗性的机制，是基于HSP具有促进蛋白形成高级结构(蛋白折叠)的功能。也就是说， HSP能够与因逆境而变性而变得无法形成正确高级结构的蛋白结合，将其折叠成正确的高级结 构，恢复该蛋白的正常功能。大量的研究结果表明，多种热休克蛋白，通过预防蛋白聚集，赋 予细菌在其极限生存温度以上继续生存的能力。因此，热休克蛋白应该有可能用于提高细菌的 培养温度、发酵产量、以及应用于其它多种多样的生物处理过程。

运动发酵单胞菌最早是Linder于1924年从龙舌兰酒中分离得到的。运动发酵单胞菌为革兰氏 阴性、厌氧细菌，能够耐一定的氧气。与其他微生物相比，该菌代谢途径相对简单，没有多种 可供选择的代谢途径。运动发酵单胞菌通过ED途径专一代谢葡萄糖、果糖、蔗糖。利用葡萄糖 和果糖时，能够得到近似理论产量的乙醇，单糖的利用效率极高。该菌具有高耐糖能力(400g/L)， 高耐乙醇能力(100g/L)、低生物量和高乙醇收率。运动发酵单胞菌乙醇发酵时，磷酸化的葡萄糖 经ED途径产生丙酮酸，再脱羧还原为乙醛，继而再还原形成乙醇；而酒精酵母发酵时，葡萄糖 经EMP途径生成了丙酮酸。EMP与ED途径相比，EMP途径1M葡萄糖可生成2M ATP，而ED途径只 生成1M ATP。相同的菌体量所消耗的葡萄糖，运动发酵单胞菌比酵母少，因此运动发酵单胞 菌发酵的乙醇得率高。

长期以来人们已经知道，培养运动发酵单胞菌需要添加赖氨酸、甲硫氨酸和一些维生素。 运动发酵单胞菌全基因组序列的测定结果，揭示了这些缺陷的具体原因。对于运动发酵单胞菌， 合成赖氨酸和合成甲硫氨酸唯一缺失的基因分别为yfdz和metB，通过从另一个来源引入这些基 因，用yfdz和metB的基因序列重组运动发酵单胞菌，将可以使运动发酵单胞菌获得自行合成赖氨 酸和甲硫氨酸的能力，可以降低其生长过程的营养要求。

原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。除个别基因外，原核生物绝大多 数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位——操纵子，如乳 糖(lac)操纵子、阿拉伯糖(ara)操纵子及色氨酸(trp)操纵子等。操纵子机制在原核基因调控中具有 较普遍的意义。一个操纵子经常含数个可转录的编码基因(通常为2～6个，有的多达20个以上)。 在同一操纵子可转录出多顺反子mRNA。