[发明专利]适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种设计及鉴定方法

权利要求书

1、选育适应于高密度种植和机械化收获的矮杆紧凑型油菜的方法，其步骤如下：

(1)以保藏编号为CCTCC-P200601的甘蓝型油菜品种5148-2为母本，以加拿黄籽油菜DH系品种YN90-1016为父本进行杂交，得到杂种F₁；

(2)于油菜开花期取杂种F₁植株主花序和上部分枝花序上大小为2.8-3.8mm的幼蕾提取小孢子，以50mg/L的秋水仙碱加倍染色体48小时，通过小孢子培养获得双单倍体(DH)分离群体；

(3)对步骤(2)的分离群体进行三年、每年两个试验点田间表型特征鉴定，选择株高、分枝特性、花序长度、角果数量、生育期五个主选性状与普通油菜存在差异的表型为矮杆、株型紧凑、分枝及主花序短小簇生、花期集中和结英层紧密的油菜变异类型材料，得到矮杆紧凑型油菜品种；

(4)利用分子标记方法对步骤(3)的矮杆紧凑型油菜品种进一步鉴定。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的分子标记鉴定步骤如下：

(1)选取待测品种及对照为矮杆紧凑型油菜的植物幼嫩叶片，用SDS法提取叶片总DNA，采用苯酚-氯仿-异戊醇法纯化总DNA以进行PCR鉴定；

(2)以步骤(1)中提取的待测品种DNA为模版，按照下列反应体系进行SSR扩增：25ng·μl^-1样本总DNA 2μl，10mmol·L^-1dNTPs 0.2μl，10×扩增缓冲液1μl，5U Taq酶0.1μl，25mmol·L^-1Mg²⁺0.8μl，50ng·μl^-1引物(上下游引物混合液)0.5μl，ddH₂O 5.4μl，总体积10μl。PCR热循环程序为：

95℃2min；1个循环；

94℃1min；60℃30s，每循环降0.5℃；72℃45s；10个循环；

94℃1min；55℃30s；72℃45s；36个循环；

72℃10min，1个循环；

常温保存；

(3)扩增产物加入等体积的变性上样缓冲液，95℃变性3min后立即冰浴冷却，然后在预先制好的丙烯酰胺变性凝胶板上加样，再在1500V稳压条件下电泳40～60min后终止电泳；

(4)小心剥下胶板，经过冰醋酸固定、ddH₂O漂洗、硝酸银溶液染色、ddH₂O漂洗、无水碳酸钠溶液显影、冰乙酸停影、ddH₂O漂洗等过程，将分离的DNA指纹用于鉴定；

(5)比较待测品种SSR扩增带型与矮杆紧凑型油菜的带型的差异；

用于矮杆紧凑型油菜SSR鉴定的引物如下：

上游引物5’TTG AAG TAG TTG GAG TAA TTG GAG G 3’

下游引物5’CAG CAG CCA CAA CCT TAC G 3’；

上游引物5’TGG ATG AAA GCA TCA ACG AG 3’

下游引物5’ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3’；

上游引物5’GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3’

下游引物5’GGG AGT TTG AAG AGA AAG CG 3’；

上游引物5’CTT TGT GGT GGG TAG TGG 3’

下游引物5’ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3’；

上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’

下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；

上游引物5’ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3’

下游引物5’AAA TGG GTC ACA GCC GAG AA 3’；

上游引物5’CCC GTC AAC CAA ATC ACA 3’

下游引物5’CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3’；

上游引物5’TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3’

下游引物5’CAA AAC TCA TCA GGG TTG TAG 3’；

上游引物5’AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3’

下游引物5’AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3’。