[发明专利]使用量子点改进聚合酶链式反应的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用量子点改进聚合酶链式反应的 专一性和产率的方法，适用于各种聚合酶链式反应的反应体系。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种快速简便的体外合成核酸的方法，在医学和 生物学中得到了广泛的应用。应用聚合酶链式反应的过程中，特异性和产率是人 们最关心的两个因素。聚合酶链式反应在实际应用中干扰的副作用很多，这些干 扰影响了聚合酶链式反应的特异性和产率，降低了工作效率。例如，引物设计问 题、引物二聚体的存在、模板DNA的GC含量、退火温度、聚合酶链式反应缓冲 液的成分等。更糟糕的是一些副作用可能导致扩增的失败。提高聚合酶链式反应 反应的专一性可以通过一些方式来实现。例如，优化引物设计、优化反应程序和 体系。其中优化聚合酶链式反应反应体系的方法可以通过加入formamide， glycerin，DMSO，BSA等到反应体系中，这在一定程度上改善了聚合酶链式反应 的非特异性。但上述的添加剂的改进效果都有各自的局限，此外一些添加剂，比 如DMSO可能会抑制DNA聚合酶的活性。

经过检索现有文献，发现优化效果比较显著的有：美国专利US PATENT 5, 646,019公开的“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体 系中加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只结合单链DNA，不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单 链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR体系的优化。但SSB蛋白合成复杂， 价格较贵，不适合商业化。中国专利ZL 200410099186.7公开了向PCR体系中添 加单质金材料来实现对PCR扩增的优化。单质金价格也不菲。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种使用量子点改进聚合酶链式反应的方法，方 法简便，操作方便，非常有效地提高了聚合酶链式反应的专一性和产率，而且很 容易的从聚合酶链式反应反应体系中去除添加剂。

为了实现上述目的，本发明通过向PCR体系中添加量子点来实现对PCR扩增 的优化，本发明的方法具体如下：

1、量子点的准备

量子点从市场上购买有4种类型：1，表面带正电荷的水溶性量子点(产品型 号：W-1001-1)，2，表面带负电荷的水溶性量子点(产品型号：W-2001-1)，3， 带有羧基功能团的水溶性量子点(产品型号：W-3001-1)，这三种均购置于武汉 珈源量子点开发技术有限公司，另外还使用了Invitrogen公司的链霉亲和素偶 联的量子点(产品型号：Q10141MP)量子点为水溶性，粒径大小为6-50nm，对 粒径大小没有限制，但粒径大小会略微影响到最适优化浓度。

2、聚合酶链式反应(PCR)体系的优化

将适量的量子点(20-50nM)加入PCR反应体系当中进行PCR扩增。

按照已有常用PCR扩增技术程序，设定如下：

首先模板94℃变性4分钟；

接着25-35个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，25-65℃退火30秒 到1分钟，72℃延伸30秒到15分钟，其中循环次数、退火温度25-65℃、退 火时间30秒到1分钟、延伸时间30秒到15分钟，可以根据待扩增对象的长度 和引物(P1、P2、P3、P4)而不同。(注释：循环次数是根据需要获得的产物量 来决定，需要的产物多，则增加循环次数，但循环次数不易超过35个循环；退 火温度是根据反应引物的Tm值来决定，Tm值减5℃为常规退火温度(45-65℃)， 但这里的体系可以通过大幅降低退火温度(25-65℃)仍能得到所需目标产物来 增加PCR的产率；根据扩增对象的长度来决定延伸时间，扩增片段每增加1000 bp，需要增加1分钟延伸时间。)

最后72℃延伸10分钟。

1.PCR产物的检测：

对扩增后的DNA样品使用质量比为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检查待扩增 条带，与对照体系进行比较。可看到在PCR体系中加入量子点可以消除非特异性 的扩增和假阳性扩增，增加聚合酶链式反应的专一性。

2.优化材料(量子点)从反应体系中的分离：