[发明专利]一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法

说明书

技术领域

本发明所涉及的一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对CSFV野毒的快速定量检测，可排除CSFV兔化弱毒(HCLV)疫苗免疫带来的假阳性。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的猪的急性、接触性传染病，死亡率高达90％以上。猪瘟在全世界范围内发生和流行，给养猪业造成严重的危害和巨大经济损失，被国际动物卫生组织(OIE)列为必须申报的法定传染病之一。我国也是猪瘟的高发国之一，近年来我国猪瘟的流行特点以散发流行、慢性猪瘟、持续感染和亚临床感染为主，使猪瘟的防治更加困难，危害日趋严重。我国政府一直都对猪瘟的防制高度重视，并相继提出了一系列的防制措施，要求对猪进行猪瘟兔化弱毒疫苗(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)免疫，但随着猪瘟HCLV疫苗的广泛使用，更增加了猪瘟的监测难度，容易产生假阳性。

现有的诊断方法如：病毒分离培养(Virus Isoloation，VI)、酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)、反转录-聚合酶链扩增法(ReverseTranscript-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、免疫荧光技术(ImmunoFluorescenceAssay，IFA)等均不能区别猪CSFV野毒感染和疫苗免疫。因此，建立一种能区别猪瘟病毒野毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断方法是一个亟待解决的问题。

猪瘟病毒的基因组为单股、正链、不分节段的RNA分子。核苷酸同源性分析表明：猪瘟病毒野毒和HCLV疫苗都有各自特有的核苷酸序列。通过设计猪瘟病毒野毒特异性的杂交探针，同时结合灵敏的检测技术，就可以对猪瘟病毒野毒特有的核苷酸序列进行检测，从而实现对猪瘟病毒野毒和疫苗的鉴别诊断。20世纪90年代中期发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)方法就可以对这类杂交探针进行高效检测。该技术是在普通PCR的基础上增加了一条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现对核酸进行定量检测的。该技术具有灵敏度高、耗时短、特异性强、可定量检测等优点。依据FQ-PCR技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种荧光定量PCR快速诊断试剂盒。

现有技术关于猪瘟病毒抗原、抗体检测及荧光定量PCR技术的文献，主要有以下几项，如专利号申请号为200710176125X的文献“检测猪瘟病毒特异抗体的方法及其酶联免疫试剂盒”公开了一种检测猪瘟病毒抗原制备和抗体检测方法，但未涉及猪瘟病毒抗原的检测；专利号为200610109404的文献“猪瘟病毒荧光RT-PCR诊断试剂盒”，专利申请号为02109350.4的“一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒及应用”公开了两种猪瘟病毒抗原的检测方法，但未涉及猪瘟病毒野毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断技术。

发明内容

本发明的另一目的在于提供一种利用荧光定量PCR技术制备了一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒能够特异灵敏地检测出猪瘟病毒野毒抗原，而免疫的HCLV疫苗抗原检测不出，从而实现猪瘟病毒野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断。

本发明的目的在于提供一种精确简便的用于定量检测猪瘟病毒野毒抗原的方法。