[发明专利]能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及物质，特别是一种能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法。

二、背景技术

中药山茱萸，又名山萸肉、萸肉、药枣、枣皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉，为常用中药材，具有补益肝肾，涩精固脱的功效，主治眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴等症。山茱萸主产于我国的河南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东亦有栽培，但山茱萸在长期应用和栽培的过程中，种内产生很大变异，出现较多栽培品种，主要表现在这些品种的果实从形状、大小、颜色、重量到产量、干果肉(药材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有较大的差异，即它们的经济价值和药材质量是明显不同的，由于其药用和商业价值，为确保真品，对其进行鉴定是必要的，随着科技的快速发展，目前基因鉴定已广为应用。

现应用较为广泛的基因遗传标记有形态标记(morphological markers)，细胞标记(cytological markers)、生化标记(biochemical markers)和分子标记(molecμlar markers)。形态标记指植物的外部特征，细胞标记主要是染色体的核型和带型.生化标记主要包括同功酶和贮藏蛋白。这3种标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映。DNA分子标记能对各个发育时期的个体、各个组织器官甚至细胞作检测，不受环境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定。所以，DNA分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣。在短暂的几十年中，经历了迅猛的发展，分子标记日趋成熟。目前，DNA分子标记技术已广泛用于生物多样性的分析、种质资源的分类演化、遗传图谱的构建、基因的分离测序、作物品种及纯度的鉴定、杂交育种等许多方面，并显示了独到的优势，那么能否利用基因制备用于山茱萸品种鉴定的DNA片段呢？

三、发明内容

针对上述情况，本发明之目的就是提供一种能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法，可有效解决山茱萸种质资源分析、药材鉴别、杂交育种，防止山茱萸假品出现的问题，其解决的技术方案是，根据分子生物学研究发现，生物类药材所依赖的资源-“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性最直接，最好是在DNA分子水平上进行检测，根据山茱萸遗传基因特征，ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp。

其制备方法是：取山茱萸植物叶片研碎成细粉，将细粉置于提取缓冲液中，离心，弃去上清夜，再加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巯基乙醇，混匀，加入由等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)制成的溶液处理2次，除去杂质，离心，取上清液，加入异丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物质，再利用DNA物质制备RAPD片段，并对其进行克隆，对克隆后RAPD片段的DNA序列进行测定。本发明利用基因制备用于山茱萸品种鉴定的DNA片段，并可有效用于中药山茱萸的品种改良及新品种选育，可以大大缩短山茱萸品种改良及新品种选育的周期，节省成本。

四、具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明，由上述技术方案给出，本发明用于山茱萸品种鉴定的DNA片段为：ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp，其中：

ST37全长589bp为ST37的全序列-589bp，具体是：

  1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC

 81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA

161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA

241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT GACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC