[发明专利]用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及物质，特别是一种用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法。

二、背景技术

中药山茱萸，又名山萸肉、萸肉、药枣、枣皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc，除去果核的干燥成熟果肉，为常用中药材，具有补益肝肾，涩精固脱的功效，主治眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴等症。山茱萸主产于我国的河南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东亦有栽培，但山茱萸在长期应用和栽培的过程中，种内产生很大变异，出现较多栽培品种，主要表现在这些品种的果实从形状、大小、颜色、重量到产量、干果肉(药材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有较大的差异，即它们的经济价值和药材质量是明显不同的，由于其药用和商业价值，为确保真品，对其进行鉴定是必要的。

目前，应用较为广泛的遗传标记有：形态标记(morphological markers)，细胞标记(cytological markers)、生化标记(biochemical markers)和分子标记(molecμlar markers)。形态标记指植物的外部特征，细胞标记主要是染色体的核型和带型，生化标记主要包括同功酶和贮藏蛋白。这3种标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映，DNA分子标记能对各个发育时期的个体、各个组织器官甚至细胞作检测，不受环境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定。所以，DNA分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣。在短暂的几十年中，经历了迅猛的发展，分子标记日趋成熟。目前，DNA分子标记技术已广泛用于生物多样性的分析、种质资源的分类演化、遗传图谱的构建、基因的分离测序、作物品种及纯度的鉴定、杂交育种等许多方面，并显示了独到的优势，那么能否利用基因DNA对山茱萸进行真假鉴定呢？

三、发明内容

针对上述情况，本发明之目的就是提供一种用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法，可有效解决山茱萸种质资源分析、药材鉴别、杂交育种，防止山茱萸假品出现的问题，其解决的技术方案是，根据分子生物学研究发现，生物类药材所依赖的资源-“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性最直接，最好是在DNA分子水平上进行检测，据此，本发明用于山茱萸品种鉴定的DNA片段为10条(5对)DNA片段，它们是：

P1/P2：5′CTTGTCTGTGGATGGT 3′/5′GTGTGGATTTTATTGG 3′；

P3/P4：5′TAGCCCGAGGTGTTCT 3′/5′TCTTGTTCCCGTTGTT3′；

P5/P6：5′TCGGTGTGTTGAGTATTGGC 3′/5′TCGTTGTTTTTTATGCTGGT 3′；

P7/P8：5′TGTGGCAGGGACTTCA 3′/5′GCATCAGCAAAAACGG 3′；

P9/P10：5′CGACAAGTGGTGGTTGAGACG 3′/5′CACGCACGACAGGACGCT 3′，

其制备方法是：取山茱萸植物叶片研碎成细粉，将细粉置于提取缓冲液中，离心，弃去上清液，再加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巯基乙醇，混匀，加入由等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)制成的溶液处理2次，除去杂质，离心，取上清液，加入异丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物质，再利用DNA物质制备RAPD片段，并对其进行克隆，对克隆后RAPD片段的DNA序列进行测定，根据测定的DNA序列设计出了5对(10条)DNA片段，本发明可用于中药山茱萸品种的鉴定及与其混伪品的鉴别，并可有效用于中药山茱萸的品种改良及新品种选育，利用设计的5对(10条)DNA片段可分别对山茱萸幼苗进行鉴定，可以大大缩短山茱萸品种改良及新品种选育的周期，节省成本。

四、具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明，由上述技术方案给出，本发明的DNA片段是由10条(5对)序列构成的物质，具体是：

P1/P2：5′CTTGTCTGTGGATGGT 3′/5′GTGTGGATTTTATTGG 3′；

P3/P4：5′TAGCCCGAGGTGTTCT 3′/5′TCTTGTTCCCGTTGTT3′；