[发明专利]三种甘薯病毒的多重RT－PCR检测方法

权利要求书

1.三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，

(1)分别合成甘薯潜隐病毒引物SEQ1、SEQ2，甘薯G病毒引物SEQ3、SEQ4和甘薯羽状斑驳病毒引物SEQ5、SEQ6；

其中，SEQ1：5′-CTTCAGTGACGTTGCTGAAGC-3′，

      SEQ2：5′-TGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′，

      SEQ3：5′-CCAAATATCAATGGTGATTGGGT-3′，

      SEQ4：5′-CCACGCATTCCAAGTAGTGTGTGT-3′，

      SEQ5：5′-GCACCAATGGCAAATGGAAGAATAG-3′，

      SEQ6：5′-GAGGTTATGTATATTCCTTGTAAC-3′；

(2)提取感病牵牛叶片的总RNA，作为PCR模板，进行反转录；

(3)将所述SEQ1、SEQ3、SEQ5引物等体积混合形成上游引物混合物，将所述SEQ2、SEQ4、SEQ6引物等体积混合形成下游引物混合物，然后将所述上、下游引物混合物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；

(4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2.根据权利要求1所述的三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录的反应体系为10μl，包括1μl 10×RT buffer、2μl浓度为25mM的MgCl₂、1μl浓度各为10mM的dNTP混合物、0.5μl浓度为2.5μM的Oligo dT引物、10U RNase抑制剂、2.5UAMV反转录酶和4.75μl病毒的总RNA；反转录反应程序为：42℃30min，99℃5min，5℃5min。

3.根据权利要求1所述的三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为50μl，包括10μl 5×PCR buffer、2.5U Taq酶、0.5μl浓度各为10mM的dNTP混合物、1μl上游混合引物、1μl下游混合引物，其中每种引物浓度均为10μM，用5μl反转录产物作模板，用DEPC-H₂O补足至50μl。

4.根据权利要求1所述的三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。