[发明专利]Exendin-4高产工程菌株的构建方法无效
| 申请号： | 200810049810.0 | 申请日： | 2008-05-19 |
| 公开（公告）号： | CN101586104A | 公开（公告）日： | 2009-11-25 |
| 发明（设计）人： | 王小纯;祖向阳;孟凡荣 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 郑州中原专利事务所有限公司 | 代理人： | 张绍琳 |
| 地址： | 450002*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | exendin 高产 工程 菌株 构建 方法 | ||
1.一种Exendin-4高产工程菌株的构建方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：
(1)Exendin-4基因的改造：依据大肠杆菌密码子嗜性及Genebank中登录编号为AAB22006的Exendin-4多肽的序列，设计编码Exendin-4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的Exendin-4基因；人工合成SEQ ID No.1所示的Exendin-4基因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′为正向引物，以5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′为反向引物，在SEQ ID No.I所示的Exendin-4基因5′端加上限制性内切酶Kpn I识别位点；在Kpn I识别位点后添加编码肠激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识别位点的核酸序列与Exendin-4基因紧密相连；在SEQ ID No.I所示的Exendin-4基因3′端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶NcoI识别位点CCATGG；
(2)克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建：利用PCR扩增的步骤(1)所述的改造后的Exendin-4基因，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-Exendin-4；
(3)高效表达载体pET-32a(+)-Exendin-4的构建：用限制性内切酶KpnI和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶KpnI和Nco I消化表达载体质粒pET-32a(+)，回收载体pET-32a(+)大片段，将二者连接即重组Exendin-4表达载体pET-32a(+)-Exendin-4；将表达载体pET-32a(+)-Exendin-4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4高产工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4。
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