[发明专利]一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种预防家禽传染病的疫苗制备方法，具体地讲涉及一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法。

背景技术

联苗是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗，联苗可简化接种程序，减少接种动物应激反应的次数，此外对于产蛋鸡，尤其是种鸡应尽可能避免或减少在产蛋期间做免疫接种，而鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗(简称禽流感四联灭活疫苗)主要是在开产前使用，使用剂量与单苗相当，但其效力与单苗相同，具有使用简便、接种程序简单等优点，减少疫苗的免疫次数，避免家禽产生不必要的应激，达到事半功倍的效果。

一般情况下，要制作联苗，就必须浓缩抗原，浓缩技术成为近年来研究联苗的热点技术，主要的方法有超速离心法、中空纤维法、超滤浓缩法。

发明内容

为了克服现有技术不足，本发明公开了一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，通过本发明制成了禽流感四联灭活疫苗可以有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感和减蛋综合征的发生，同时也可以大大降低人们的劳动强度，降低畜禽死亡率，减少养殖户的损失，造福人类。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

所述一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其制备方法步骤如下：

①、生产用毒种的制备：将NDV La Sota株毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释；将NDV La Sota株毒种和IBV M₄₁株毒种分别接种9～10日龄SPF鸡胚上，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将AIVHL株毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释后，接种9～10日龄SPF鸡胚，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将EDSV AV127病毒毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释后接种10～11日龄易感鸭胚，置37℃继续孵育，收获鸭胚液；

②、制苗用病毒液的制备：将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释，将NDV La Sota株毒种和IBV M₄₁株毒种同时接种9～10日龄SPF同一鸡胚上，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将AIV HL株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释后，接种9～10日龄SPF鸡胚，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将EDSVAV127病毒生产毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释后接种10～11日龄易感鸭胚，置37℃继续孵育，收获鸭胚液；将NDV La Sota株、IBV M₄₁株、AIV HL株病毒液作3.5倍浓缩，将EDSVAV127株病毒液作4倍浓缩；浓缩后分别灭活；

③、灭活疫苗的制备：

取灭活的浓缩3.5倍NDV La Sota株、IBV M₄₁株、AIV HL株病毒液和浓缩4倍的EDSV AV127株病毒液按1∶1∶1∶1.5的比例混合，取混合后的病毒液97～99份(体积份)，加入吐温-801～3份(体积份)，混合制成水相；取白油96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2(体积份)份制成油相；

④、将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1∶1.5～2.5，一起乳化，即制得禽流感四联灭活疫苗，分装，贴签，装箱、入库。

本发明所采用的灭活是指，IBV M41病毒液创新采用低温灭活，2～8℃经120～145小时，并将浓缩后的NDV La Sota、AIV HL株和EDS AV127株病毒液，分别加入0.05～0.15％甲醛溶液，经35～38℃灭活12～17小时，可彻底灭活病毒，并不影响其免疫原性。

本发明所采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘，实验证明含油相和水相乳化剂的疫苗比仅含油相的疫苗免疫效果好，可使抗原充分混合均匀，不易分层，在37℃条件下更稳定，黏度也低。

本发明采用了纤维膜超滤浓缩法，可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度达4倍以上，纤维膜超滤浓缩装置，设有二级孔径不同的纤维滤柱，一级滤柱的纤维可滤除部分细菌和杂质，二级超滤株的中空纤维可截留病毒粒子。