[发明专利]一种胸腺素alphal(Tal)类似物及生产工艺和医用途

说明书

技术领域

本发明公开一种胸腺素alpha1(Tα1)类似物及生产工艺和医用途，通过对天然蛋白的分子设计与基因工程改造，得到了具有更强生物学活性的天然蛋白类似物，属于重组蛋白质药物生产领域。

背景技术

胸腺素alpha1(简称：Tα1)是一种免疫活性肽，它主要作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，可增加T细胞表面Thy-1，Thy-2.3和Lyt-1.2.3表达，能促进T淋巴细胞的增殖，提高淋巴细胞产生干扰素和白介素2等细胞因子的能力，提高机体抗菌和抗感染的能力。因此Tα1是一种重要的免疫调节剂和增强剂。临床上主要作为原发性或继发性免疫功能缺陷病，肿瘤和慢性活动性肝炎的免疫调节剂，其安全性和有效性已经超万例临床应用所证实，长期使用，无蓄积性，无抗原性，并得到国内外相关领域专家的公认。

文献表明，Tα1是通过与其特异性受体结合从而产生特定的生物学效应，如果加强Tα1及其相应受体间的结合力，有利于提高Tα1的生物学效应，本研究针对Tα1和其相应受体的三维结构进行了计算机模拟分析，分析结果表明Tα1的11位氨基酸位点Ile突变为Val，可以使Tα1与其受体的结合力增强，从而有可能提高Tα1的体内外生物活性。针对上述结果，本发明构建了第11位突变为Val的Tα1类似物表达菌株，通过发酵，纯化得到了该类似物纯品，并对其进行了体内外生物学活性的研究。

发明内容

本发明目的在于公开一种胸腺素alpha1(Tα1)类似物，为新的重组蛋白。

本发明还公开胸腺素alpha1(Tα1)类似物的生产工艺，通过基因工程重组表达的方法获得。

本发明另一目的是提供了胸腺素alpha1(Tα1)类似物医用途。

本发明公开的胸腺素alpha1(Tα1)类似物，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

“Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn”

本发明的Tα1类似物是通过基因工程重组表达的方法获得的，包括如下步骤：

1)表达载体的构建

依据Tα1类似物氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tα1类似物DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之5’端和3’端加上限制性酶切位点，并进行N-末端修饰(加入EK酶酶切位点)，得到编码Tα1类似物的核酸序列。

再分别将如上述制备的Tα1类似物序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系，经转化、筛选得到正确的重组子；

用限制性酶切下重组子的融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的Pharmacia公司质粒pGEX连接，经筛选得到正确的重组子。

2)重组Tα1类似物的表达及分离纯化

将上述所含pGEX质粒的重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，离心收集目的蛋白高表达的菌体。高压均质破碎菌体并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用EK酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，得Tα1类似物，最终目的蛋白纯度大于98％。

一、对重组Tα1类似物的体外生物活性测定

用E玫瑰花结实验对样品进行生物活力测试：首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2×10⁶/ml。各取200μl细胞液加入EP管中，再分别加入等量的测试样品Tα1类似物与阳性对照品日达仙(天然Tα1)，37℃水浴90分钟，每支EP管中加入200μl绵羊红细胞(2×10⁶/ml)，4℃放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰花形成细胞的百分数。按以下公式计算激活率。

经测试，本发明生产的Tα1类似物体外生物活性大于天然Ta1。

二、重组Tα1类似物的体内生物活性测定

动物模型的建立：

取7周大的雌性Balb/C小鼠(每组6只)连续10天腹膜内注射0.2mL含25mg/kg的5-FU生理盐水，同时分组注射30μg/kg的测试样品Tα1类似物、30μg/kg的日达仙以及生理盐水，10天后分离胸腺细胞做流式细胞仪分析CD4⁺、CD8⁺细胞数。

流式细胞仪分析