[发明专利]抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途

权利要求书

1、抑制端粒酶活性的金属超分子化合物，其特征在于，其具有如I所示结构，为Ni²⁺或Fe²⁺，配体分子式为C₂₅H₂₀N₄，配体结构如II所示：

所述的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物包括一对结构对映异构体：P和M。

2、一种用权利要求1所述的金属超分子化合物抑制端粒酶活性的方法，其特征在于，步骤和条件如下：

细胞培养

COC1和K562细胞在37℃，5％CO₂的孵箱中培养，培养基为IMDM加10％胎牛血清，每两天换液一次，取对数生长期细胞进行实验；

Taq聚合酶活性分析

对于基于TRAP法的端粒酶活性检测方法，为排除由于样品对Taq酶活性的抑制而造成假阳性结果，有必要检测样品对Taq聚合酶活性影响，在PCR管中分别加入：oligo DNA 20ng，引物P1、P2各40pmol，dNTP 10pmol，10×ExTaq缓冲液5ul，ExTaq聚合酶2.5U，金属镍超分子化合物P或M，或者金属铁超分子化合物P或M浓度均为2umol/l，补充灭菌水至50ul，无金属超分子化合物的作为对照组，混匀后进行PCR反应，反应条件为94℃预热2分钟；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，30个循环；最后72℃10分钟；4℃保存，反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察，照相；

端粒酶活性分析

端粒酶活性的检测使用ROCHE公司生产的Telomerase PCRELISA试剂盒，过程如下：

(1)制备细胞提取物

收获对数生长期COC1细胞并计数，1500rpm，4℃离心10分钟弃上清后加PBS洗涤细胞两次，弃上清后，按每2×10⁵个细胞加200ul裂解液，冰浴30分钟，15000rpm离心20分钟转移上清液到另一管中备用；

(2)TRAP反应

在每个PCR反应管中加入以下反应物：25ul反应混合液，其成分为Tris缓冲液，包含生物素标记的P1-TS引物，P2引物，dNTP，Taq酶，2ul细胞提取物，浓度分别为10，20，40，60，80和100nmol/l的金属镍超分子化合物P或浓度分别为50，100，150，300，500和1000nmol/l的金属镍超分子化合物M或者浓度分别为5，50，500，5000nmol/l的金属铁超分子化合物P或M；DEPC水补充体积至50ul；不加金属超分子化合物的样品作为阳性对照组；细胞提取物在85℃加热10分钟为加热失活组，作为阴性对照，充分混匀后置于PCR仪内按如下程序反应：25℃，30分钟；94℃，5分钟；再按94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，30秒循环30次；最后72℃保温10分钟，4℃终止反应；

(3)检测分析反应产物

每管取反应产物5ul到新的Ep管中，加入20ul变性剂，20℃作用10分钟，再加入225ul杂交缓冲液充分混匀，该杂交缓冲液含有地高辛标记的端粒重复序列特异性探针，37℃300rpm摇晃2小时，取100ul混合液加入到用链霉亲和素预包被的96孔酶标板每孔中，37℃孵育1小时，倒净，用PBS洗涤3次，加入100ul连有过氧化物酶的抗地高辛抗体溶液，20℃300rpm振摇30分钟，倒净抗体溶液，PBS洗涤5次后加入100ul TMB溶液，25℃反应20分钟，加入100ul终止液，立即用酶标仪测450nm光吸收值OD₄₅₀；

细胞长期药物作用

COC1和K562细胞以2.0×10⁵个/瓶接种到25cm²培养瓶中，加入终浓度为1umol/l的金属镍超分子化合物或0.5umol/l的金属铁超分子化合物，不加化合物的为对照组，每3天收集一次细胞，血球计数板计数，取2.0×10⁵个重新接种到培养瓶中，剩余细胞用来做下述检测；

端粒长度测定

收集上述细胞，提取基因组DNA，采用荧光实时定量PCR测定端粒的相对长度，所用试剂购自大连宝生物工程有限责任公司，过程如下：

在每个PCR玻璃毛细管中加入以下反应物：10ul 2×Syber GreenPCR Master Mix，20～100ng基因组DNA，扩增端粒加入终浓度200nmol/l的端粒序列引物，扩增单拷贝基因36B4则加入终浓度300nmol/l的36B4序列引物，补充水到20ul，扩增在ROCHE Lightcycler system仪器上进行，程序如下：95℃，1分钟一个循环；然后95℃15秒，58℃15秒，72℃40秒循环40次扩增36B4或者95℃15秒，56℃15秒，72℃60秒循环35次扩增端粒基因，每一个样品分别进行2次PCR反应，分别测定扩增端粒序列的Ct值和扩增36B4序列的Ct值，为建立标准曲线，从未加化合物的细胞中提取基因组DNA，从3.125ng/管to 100ng/管成倍稀释加入到玻璃毛细管中并测定Ct值，Ct值的计算和标准曲线的建立使用LightCycler分析软件，用来计算样品相对端粒长度的T/S比率计算公式为T/S≈2^ΔΔCt，ΔΔC_t＝ΔC_t样品-ΔC_t对照，ΔC_t＝C_t36B4-C_t端粒。

3、如权利要求1所述的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物的用途，其特征在于，其用作抗肿瘤药物。