[发明专利]人血清中血管生成素检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程中的免疫学技术领域，具体涉及人血清中血管生成素检测方法及其应用。

背景技术

肿瘤的发生、发展和转移与新生血管的形成密切相关，血管生成的过程受很多重要的血管生成因子和受体调控。一些可溶性的血管生成因子能够在血浆中检测到，目前已分离和纯化了20多种血管生成因子和相关因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、血管生成素(angiogenin)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等，它们通过各种机制降解血管基底膜和周围细胞外基质，促进内皮细胞分裂、游走和增殖，诱导宿主毛细血管新生。大量的研究表明肿瘤患者血清中血管生成因子的表达水平与肿瘤的级别，入侵程度，肿瘤地位，远距离转移和临床阶段都是正相关的。在众多的血管生成因子中，血管生成素是迄今为止惟一一个基于其促进血管新生能力而被发现和分离纯化的血管生成因子，其重要性越来越受到重视，已逐渐成为研究的热点之一。时至今日，人们通过对血管生成素结构、性质及功能等的大量研究，已初步了解了其促进血管生成作用的机理，并在肿瘤检测、治疗和预后等方面取得了一定的成果。

血管生成素在许多肿瘤中都有表达，血清中的血管生成素表达水平上升。血管生成素与肿瘤的快速生长、浸润、转移、分期及预后均有密切关系。人们通过对肿瘤生长过程中血管生成素表达水平的大量研究发现，血管生成素与肿瘤的快速生长、浸润、转移、分期及预后均有密切关系。在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴管瘤以及黑色素瘤等多种癌症患者的血清中血管生成素的水平都高于健康个体，而且这种水平的高低与癌症的恶性化程度相关。建立人血清中血管生成素检测方法，有利于开发肿瘤临床诊断试剂。

发明内容

本发明的目的是确立一种能够用于血管生成素检测的有效方法。

本发明的方案：

按常规方法表达并纯化人血管生成素蛋白，制备人血管生成素抗体，为血管生成素血清检测提供实验基础。分别采用竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中的血管生成素，采用了兔抗人血管生成素多克隆抗体进行竞争ELISA，鼠抗人血管生成素单克隆抗体和兔抗人血管生成素多克隆抗体进行夹心ELISA，检测人血清中的血管生成素，棋盘滴定法优化ELISA实验条件，确定最适血清稀释倍数和抗原抗体稀释倍数。联合两种检测方法，分析人血清血管生成素的检出率。

本发明是采用竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素含量，并对结果进行分析，联合两种检测方法，可以相互补充，提高了人血清血管生成素的检出率。

具体实施方式

一、双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素

1)重组人血管生成素蛋白的表达、纯化

利用RT-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段，测序正确后克隆入表达载体pET28-a(+)中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导，表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni²⁺高亲合力结合的性质，经镍柱纯化，获得了高纯度的血管生成素融合蛋白。

2)人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体的制备

按常规方法制备人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体。

3)双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素

我们采用了人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体进行夹心ELISA检测人血清中的血管生成素。

(1)ELISA实验条件的确定