[发明专利]重组人胸腺素β16制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程领域。

背景技术：

胸腺素是一类家族多肽的统称，它们广泛存在于人体及动物体内。这些小分子多肽由40-45个氨基酸组成，家族成员间的序列高度保守，分子量大多在5kDa左右，是一类具有极性的多肽分子。

根据家族成员各自的等电点差异，胸腺素可被分为α型、β型和γ型。其中，由于在各种生理生化过程中都起到重要的作用，β型家族成员的作用及作用机制逐渐成为了近年来的研究热点之一。国外化学合成的胸腺素β4应用于角膜修复和皮肤烧烫伤、溃疡修复等已经进入II期临床。但采用化学合成法，成本高，易造成环境污染。

β型家族的16个成员中，含量最多、组织分布最广的是胸腺素Tβ₄，Tβ₄不但在调节免疫系统、神经系统功能和发育方面具有重要作用，还可调节肌动蛋白的聚合与分离。而最重要的，也是目前基础医学研究和临床应用研究均集中的方面——血管再生作用，血管再生是创伤后愈合的前提条件。而Tβ₁₆是新近发现的家族成员，其研究尚不深入，且数据积累少，现已知其在功能域部分与Tβ₄具有高度的同源性，如下表所示。

              5     10    15    20    25    30    35    40

Tβ16 ac-SDKP DLSEV EKFDR SKLKK TNTEE KNTLP SKETI QQEKE CVQTS

Tβ4  ac-SDKP DMAEI EKFDK SKLKK TETQE KNPLP SKETI EQEKQ AGES

二者差异仅为一个氨基酸，而且二者在二级结构上并无明显差异，因此，对Tβ₁₆的性质及药理药效研究可以参照Tβ₄的研究方法进行。

发明内容：

本发明的目的是采用基因工程技术制备重组胸腺素β₁₆。

本发明重组人胸腺素β16的氨基酸序列SEQ ID NO：1。

本发明sumo融合重组胸腺素β16的氨基酸序列SEQ ID NO：2。

本发明重组人胸腺素β16的原核表达制备方法是利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签，构建pET/SUMO-Tβ₁₆大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素β16。

本发明重组人胸腺素β16的原核表达制备方法是利用GST作为表达重组蛋白的融合标签，构建了pGEX-Tβ₁₆大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素β16。

本发明重组人胸腺素β16的原核表达制备方法是利用pTW-Tβ16融合蛋白基因在大肠杆菌表达出CBD-intein1-Tβ16-intein2-CBD融合蛋白，通过几丁质柱层析，温度及pH的改变即可诱导内含肽(intein)发生裂解，释放出目的蛋白Tβ₁₆。

本发明重组人胸腺素β16的真核表达制备方法是：

a、利用毕赤酵母偏好的密码子合成Tβ₁₆基因，构建pPIC9K/Tβ16工程菌；

b、酵母工程菌培养采用甲醇诱导；

c、重组人胸腺素β₁₆的制备与纯化是收集上清，经Ni-chelatingSepharose亲和层析纯化蛋白，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。

本发明重组人胸腺素β16作为药物在皮肤烧烫伤、碱烧伤和溃疡的修复方面的应用。

本发明重组人胸腺素β16作为药物在角膜创伤修复方面的应用。

本发明Tβ₁₆作为胸腺素家族成员之一，在促进伤口愈合的作用中不同于市场上应用的或正在开发中的同功药物。Tβ₁₆不是生长因子，与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有以下几方面优点：

1)特异性地刺激上皮细胞移动，促进上皮细胞角化；

2)特异性地刺激内皮细胞移动，促进血管形成；

3)分子量很小，只有45个氨基酸(生长因子属大分子蛋白)，易在组织内扩散；

4)结构相对简单，功能明确、特异，副作用小，可局部反复应用；

5)多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样(如喷雾、透皮吸收等)，作用持续时间长，可减少用药次数；

6)胸腺素β₁₆能直接作用于细胞骨架系统，具有支持细胞结构稳定性的作用。