[发明专利]一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞体外分离培养方法，具体地说，本发明涉及一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法。

背景技术

乳腺是复管泡状皮肤腺，乳腺上皮具有特殊的乳汁分泌功能，乳汁的许多成分只有乳腺上皮细胞才能够合成，因此进行乳腺上皮细胞的分离培养是研究乳腺功能及其调控的重要手段之一。乳腺细胞培养已有半个世纪的历史，自Lasfargues(1957)利用胶原酶消化法将乳腺细胞从乳腺组织中分离出来，众多科学家开展了广泛研究。

体外细胞分离培养技术是使细胞生命活动的主要方面在体外得以再现的一种基本方法，自创立以来几乎被应用到生物和医学等研究的各个领域。目前的细胞培养方法主要是利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶敏感性的不同及贴壁时间的差异，可将其纯化，最终能够得到相应的细胞系。其不足之处是不同动物种类的乳腺细胞对胰蛋白酶敏感性不同，因此确定最佳胰蛋白酶浓度分离培养奶牛乳腺上皮细胞是改进技术的关键环节。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种分离培养奶牛乳腺上皮细胞时最佳胰蛋白酶浓度，且较好地将奶牛乳腺纤维细胞和上皮细胞分离，并得到奶牛乳腺细胞系的一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法，可采取自当地屠宰厂当日屠宰的奶牛乳腺组织，利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶敏感性的不同及贴壁时间的差异，采用组织块培养法和胰蛋白酶分级消化法相结合，使用0.05～0.07％胰蛋白酶/EDTA分离培养奶牛乳腺上皮细胞，将奶牛乳腺细胞纯化，经角蛋白18鉴定后，最终得到相应的奶牛乳腺细胞系。

所述胰蛋白酶最佳浓度为：使用0.06％胰蛋白酶/EDTA分离培养奶牛乳腺上皮细胞。

本发明的有益效果是：提供了一种分离培养奶牛乳腺上皮细胞时最佳胰蛋白酶浓度，且较好地将奶牛乳腺纤维细胞和上皮细胞分离，并得到奶牛乳腺细胞系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式的实际操作步骤对本发明做进一步描述。

(1)奶牛乳腺组织原代培养

取本地当日屠宰的健康黑白花奶牛乳腺组织，置于冰盒中带回实验室。乳腺组织经75％酒精浸泡消毒，在超净工作台中将乳腺组织块移入加有细胞培养液的平皿中，剪成直径约3mm的小块，用吸管吸取培养液反复洗涤，用眼科剪和眼科镊尽量分离结缔组织和脂肪组织，然后剪成直径约1mm的小块，接入培养皿内，每小块间距0.5cm左右。为防止组织块干燥，培养皿中央加入2滴细胞生长液。将培养皿置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中，培养4h后取出，轻轻加入3mL细胞培养液，置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，每2d换液1次培养液。

(2)细胞传代及上皮细胞的纯化

待细胞生长至80％～90％汇合时，剔除组织块，使用0.06％胰蛋白酶/EDTA和37℃条件下消化，倒置显微镜下观察，在成纤维细胞变圆后即中止消化，轻轻吹吸几次后，吸出消化液，离心再用PBS洗3遍，然后在培养物中加入0.15％胰蛋白酶/EDTA，37℃条件下继续消化，在倒置显微镜下观察，待上皮细胞变圆脱壁后，终止消化，轻轻吹打，制成细胞悬液，计数、稀释、接种于其它平皿中继续培养，每2d换液一次。

(3)奶牛乳腺上皮细胞冻存和解冻复苏培养

对数生长期细胞，经0.15％胰蛋白酶/EDTA，37℃条件下消化制成细胞悬液，1000rpm离心5min，收集细胞；用冷冻保护液(20％FBS、10％DMSO的DMEM/F12培养液)调整细胞数至1×10⁶细胞1mL，每个冷冻管中分装1mL，室温平衡5min，4℃40min，-20℃冰箱过夜，然后放入液氮罐中长期保存。从液氮罐中取出冻存管，在37℃的水浴中保温1～2min，使其完全融化。加入5mL培养液悬浮细胞，1000rpm离心5min，收集细胞；再加入5mL培养液重悬细胞，将其接种于细胞培养皿中，于37℃和5％CO₂，在饱和湿度条件下培养，当细胞生长至约70％～80％汇合度，传代扩大培养。