[发明专利]抗aFGF－scFv在制备抗肿瘤药物中的应用及其制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的应用，同时还提供了其制备方 法，属于生物制药技术领域。

背景技术

本发明涉及的“抗aFGF-scFv”是申请人的另一发明专利(ZL200510119045.1)《抗 人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因》的表达产物。本案申请公开了该产物在 抗肿瘤方面的医用用途和制备方法。

发明内容

本发明公开了抗aFGF-scFv在制备抗肿瘤药物中的用途，用于制备抗肿瘤的药物。

本发明还提供了抗aFGF-scFv的制备方法，分别在大肠杆菌，植物和酵母中实现 了表达，适用于工业化生产。

本发明的制备方法具体步骤如下：

根据scFv的序列设计引物，进行PCR扩增，对PCR产物回收并进行双酶切反应， 在T4连接酶催化下将scFv片段克隆入表达载体，将表达载体转化到目的细胞，制备 出抗aFGF-scFv。所述的目的细胞包括：大肠杆菌或植物、酵母细胞。

以下药理实验证明本发明具有抗肿瘤的药理活性果：

实验例1抗酸性成纤维细胞生长因子单链抗体的应用

1哺乳动物细胞表达载体pEGFPC1-scFv的构建

由测序得到的轻链和重链的序列，设计了一对扩增V_L的引物V_L-forward，V_L-reverse 和一对扩增V_H的引物V_H-forward，V_H-reverse。根据Overlap PCR的原理，引物 V_L-reverse和V_H-forward具有一段互补的序列。在V_L和V_L分别扩增延长后，V_L的3′ 端和V_H的5′端即具有一段互补的碱基序列，在退火的时候，V_L和V_H可以通过这一段 序列配对结合，然后延伸，扩增出V_L-linker-V_H片段。Linker的序列为 GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGA GGTGGCTCTGGCGGAGGTGGCTCT，共45bp，编码的氨基酸序列 为(Gly₄Ser)₃。

(1)根据V_H，V_L基因测序结果，用软件Primer5.0设计了 扩增V_L基因的一对引物：

V_L-forward：5′CCG GAA TTC GAC ATC CAG ATG ACC CAG-3′， 加入Bgl II酶切位点。

V_L-reverse：5′AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT-3′

扩增V_H基因的一对引物：

V_H-forward：5′GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGA GGT GGC TCT CAG GTG AAG CTG CAG C-3′

V_H-reverse：5′CCC AAG CTT CTA TGA GGA GAC GGT GAC-3′， 加入Hind III酶切位点。

(2)V_H，V_L基因片段分别扩增。在两个PCR小管中分别加入：

            PCR for V_L扩增                       PCR for V_H扩增

One Shot LA PCR Mix       25μl       One Shot LA PCR Mix     25μl

V_L-forward                1μl        V_H-forward              1μl