[发明专利]细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，属于生物技术领域。

背景技术：

荧光显微镜观察与计数是细菌活的非可培养状态(Viable butNon-culturable，VBNC)研究所用的最基本的技术手段。目前，国内外用于VBNC细菌荧光观察与计数的现有技术主要源自于Hobbie等人于1977年在《应用与环境微生物学》上发表的一篇题为“利用核孔滤膜进行细菌荧光计数”的文章。该技术的一大亮点就是利用聚碳酸酯核孔滤膜替代纤维素微孔滤膜，用于细菌总菌数的测定。同时还利用吖啶橙和萘啶酮酸对细菌核染，用以区分细菌的“死”与“活”。除此之外，该项技术所涉及的材料还包括伊拉克黑、甲醛、可换膜针头式滤器等。其具体技术措施如下。首先，在适当浓度的稀释液中加入终浓度为0.001％的萘啶酮酸和0.025％酵母膏，37℃培养16h—24h，随后加入2％甲醛固定(终浓度)，而后再加入0.1％的吖啶橙溶液染色3min。将稀释液中的细菌过滤到直径25mm孔径0.2um的核孔滤膜上。为消除滤膜本身的荧光，滤膜先用0.2％伊拉克黑的2％醋酸溶液染色24h。最后将滤膜放在载玻片上滴一滴无自发荧光的香柏油，在油上盖一张盖玻片，在盖玻片上再滴加一滴无自发荧光的香柏油，于落射荧光显微镜下进行观察计数。通过上述方法，细菌总数能被客观地计数出来，并且活菌与死菌也能被明显地区分开来。因此，该技术在VBNC细菌研究领域中被广泛应用。但是随着VBNC研究范围的不断扩大，具有VBNC性质的细菌种类也越来越多，已不局限于当初发现的16个种属的30多种细菌。不但革兰氏阴性病原菌存在VBNC状态，革兰氏阳性益生菌也存在；不但水中细菌存在，土壤、空气、动植物体内细菌也存在。那么此项技术在该领域研究中也显现出了储多不利方面，存在着一定的局限性。归纳其技术缺点如下：(1)操作繁琐，耗费时间，不利于VBNC细菌的快速检测。一般地，在观察VBNC细菌时，需用萘啶酮酸抑制细菌生长16h—24h。(2)适用范围窄，仅对革兰氏阴性菌适用，而对革兰氏阳性则不适用。(3)不能真实反映活菌数量。经吖啶橙染色，呈现橙黄或橙红色荧光的菌体难于有效确定是活菌还是死菌。(4)所用材料种类多，且取材不便。例如，伊拉克黑是在印染工业中所使用的一种黑色染料，但在国内各大生化及生物公司却很少销售此类物质。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，其以SYTO-9和PI替代吖啶橙和萘啶酮酸，以市售的黑色钢笔墨水替代伊拉克黑，自行建立了一套VBNC细菌荧光显微镜观察与计数方法，简化了操作流程，克服了现有技术的适用范围狭窄、取材困难、观察结果不准确等缺点，解决了细菌VBNC研究领域中的技术难题，提高同业者的实践操作水平。

本发明的技术方案是这样实现的：细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，其特征在于：具体步骤是

1、VBNC细菌观察样本的前处理

VBNC细菌诱导前的菌液浓度为10⁵—10⁶个/mL，取可培养菌数为1×10⁶个/mL的VBNC细菌液1mL至无菌离心管中，8000r/min离心2min，弃上清；然后用灭菌生理盐水充分洗涤菌体沉淀2次，每次均8000r/min，离心2min，弃上清；洗涤菌体时，应尽可能地除尽细菌培养液，以免培养液产生自发光而干扰观察结果；最后需将洗涤完毕的沉淀置于室温，用于立即观察；或者将菌体保存于4℃，在2天内备用；

2、微孔滤膜疏水性检查与处理

首先将直径25mm孔径0.2um的微孔滤膜完全浸入灭菌生理盐水中2min，再将微孔滤膜取出置于平皿中，光面朝上，仔细观察微孔滤膜表面，若微孔滤膜表面有部分面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更换；或者将疏水滤膜浸入0.5％的吐温-80中，浸泡1min，而后将微孔滤膜转入可换膜针头式滤器内，在针管内注入灭菌生理盐水2mL，一并将吐温-80和盐水滤出；验证后的和吐温-80处理后的滤膜均光面朝上平铺于平皿内，37℃烘干，室温存放备用，微孔滤膜最好直接使用亲水性滤膜；

3、微孔滤膜染色

将上述处理完毕的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不能重叠；而后用吸管吸取适量“英雄牌”黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处滴一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜后，将平皿移至干热箱内，60℃烤膜20min，其间需用镊子轻轻夹起滤膜翻动2次，而后冷却，室温存放备用；

4、VBNC细菌样本荧光染色