[发明专利]一种合成三聚氰胺完全抗原的方法及检测三聚氰胺的ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，尤其是提供了应用单克隆抗体术研制的检测三聚氰胺的ELISA试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于酶联免疫技术领域。

背景技术

三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂。三聚氰胺含氮量为66.6％，折合成粗蛋白含量为416.27％，掺入少量就可以迅速提高蛋白含量，使产品在常规检查中显得含有较高的蛋白质，常被不法商贩冒充成高蛋白物质加入，以提高检测时食品中蛋白质检测数值，还能大幅度降低成本。由于三聚氰胺不溶解在水里，抗氨氮测定，加上三聚氰胺为白色粉末，易被染色，很容易混入原料中而不被发现。所以一般的分析化验部门很难分析出来。

国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》(第三卷)表明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石，因此三聚氰胺是一种禁止用于食品及动物饲料的化学物质。

目前，三聚氰胺检测方法主要是气相色谱法和高效液相色谱法。高效液相色谱法虽操作简单，但检出限较高，无法满足对三聚氰胺低残留限量的要求；气相色谱法灵敏度较高，但样品前处理过程复杂、分析速度慢，不适合在基层推广使用；并且气相色谱法和高效液相色谱法需要昂贵的专门设备，不适合现场检测，对检测人员的技术要求较高。

基于抗原抗体特异性反应建立起来的ELISA检测方法，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强和价格低廉等诸多优点，可以直接用于生产实践。

发明内容：

本发明公开一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，用于制备单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还提供了应用单克隆抗体检测三聚氰胺的直接竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，适合工厂化生产。

本发明公开的人工合成三聚氰胺完全抗原是通过以下方法得到的：

以三聚氰胺为半抗原，通过戊二醛法与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原。

本发明提供的ELISA检测试剂盒的组成包括：

三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。

所述单克隆抗体为以三聚氰胺为半抗原，通过与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原，并通过小鼠免疫、细胞融合、筛选及克隆化培养制得；所述三聚氰胺酶标物采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述方法为过碘酸钠法；所述样品稀释液为含0.1％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；所述酶标物稀释液为含0.01％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；底物显色液：A液为0.1mol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.3％过氧化氢储备液，每1mL缓冲液加入14uL储备液，制成使用液；B液为四甲基联苯胺，先用丙酮配成0.2mg/mL溶液，用0.1mol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/L溶液。

另一方面，本发明还提供检测样品中三聚氰胺含量的方法，步骤如下：

(1)样品前处理

(2)用权利要求2所述的ELISA检测试剂盒检测，向包被三聚氰胺单抗的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，加入三聚氰胺酶标物，孵育30分钟，洗涤液洗涤，加入显色液孵育20分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值。

(3)分析检测结果

本发明人工合成三聚氰胺完全抗原的原理为：

戊二醛(GA)是一种同型双功能交联剂，它的两个功能基可以与多聚赖氨酸和三聚氰胺上的氨基结合，形成多聚赖氨酸-GA-三聚氰胺的结合物。用两步法先将多聚赖氨酸与过量的GA反应，形成二者的结合物，然后再将该结合物与抗体蛋白质分子的氨基交联，形成多聚赖氨酸-GA-三聚氰胺的结合物，制备成三聚氰胺的完全抗原，可用于免疫动物制备单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明试剂盒的检测原理为：

将抗三聚氰胺的单克隆抗体包被于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入三聚氰胺酶标物，待检样品中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标物竞争包被于固相载体上的单克隆抗体，通过洗涤除去未结合的三聚氰胺酶标物，加入显色液显色后终止反应，测定样品吸光度值，改值与样品中三聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即可测定样品中三聚氰胺的浓度。

本发明的积极效果在于：