[发明专利]一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法无效
| 申请号： | 200810051514.4 | 申请日： | 2008-12-03 |
| 公开（公告）号： | CN101412973A | 公开（公告）日： | 2009-04-22 |
| 发明（设计）人： | 王丕武;李晓婷;付永平;曲静 | 申请（专利权）人： | 吉林农业大学 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12N9/42;C12N9/24;C12R1/85 |
| 代理公司： | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 | 代理人： | 魏征骥 |
| 地址： | 130118吉*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 具有 纤维素酶 活性 粟酒裂殖 酵母 工程 及其 构建 方法 | ||
1、一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建的含有半纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。
2、如权利要求1所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征是将半纤维素酶基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖酵母表达质粒导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使半纤维素酶基因得到分泌表达。
3、根据权利要求1所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：重组粟酒裂殖酵母表达载体含有Pnmt1启动子、半纤维素酶基因、Pnmt1终止子序列、以及筛选标志。
4、根据权利要求3所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：重组粟酒裂殖酵母表达载体含有半纤维素酶基因为内切木聚糖酶基因XYNB，其序列如SEQ IDNO.1所述和木糖苷酶基因XLND，其序列如SEQ ID NO.2所述。
5、根据权利要求4所述具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：内切木聚糖酶XYNB基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位点处的XhoI和SalI限制性内切酶酶切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESPUC-XYNB，获得的重组粟酒裂殖酵母工程菌为SP-Q01/pESPUC-XYNB，所述半纤维素酶XLND基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位点处的BamHI和NotI限制性酶酶内切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESPUC-XLND，获得的重组粟酒裂殖酵母菌株为SP-Q01/pESPUC-XLND。
6、根据权利要求3所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：筛选标志一种为氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance Amp+)，其允许在大肠杆菌(E.coli)克隆时进行载体的复制和抗生素选择；另一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiea)可以作为向粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞中转化表达结构的选择标定物亮氨酸。
7、根据权利要求2所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于：半纤维素酶基因的表达是将构建的含有半纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体的质粒DNA，采用电穿孔法导入粟酒裂殖酵母SP-Q01中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母转化子使半纤维素酶基因得到分泌表达。
8、根据权利要求7所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征在于：重组粟酒裂殖酵母在表达半纤维素酶基因无须加入诱导物，半纤维素酶基因前端自带的信号肽序列可使半纤维素酶基因获得分泌表达，表达时间为2～6天。
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