[发明专利]VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，确切地说是“活的非可培养状态”沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法。

背景技术

细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable，VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，常被看作VBNC细菌鉴定、检测所用的最能客观评价VBNC的基本技术手段。目前，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在Applied and Environmental Microbiology刊物上的一篇题为《Resuscitation ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium and Enterohemorrhagic Escherichia coli from the Viablebut Nonculturable State by Heat-Stable Enterobacterial Autoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30％牛血清和50μmol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，基中SAPI培养基成份较为复杂，由6.25mmol/LNH₄NO₃，1.84mmol/L KH₂PO₄，3.35mmol/LKCl，1.01mmol/L MgSO₄，2.77mmol/L(pH＝7.5)葡萄糖等组成。主要复苏步骤如下：首先将SAPI培养基6000r/min，离心15min，上清液过滤除菌。然后将滤后的上清液涂于羊血琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，以检测培养基中是否有杂菌污染。最后将可能含有10²～10³个CFU/mL浓度的VBNC沙门氏菌无菌接种于SAPI中，37℃厌氧培养至OD₆₂₀＝0.4时，细菌数量增多，浓度可接近10⁸个CFU/mL。通过此法可以使维持VBNC长达1年的细菌恢复为可培养状态。从总体上讲，该种方法复苏效果较好，但存在的缺点也较多。(1)复苏液所涉及的材料种类多，至少需要8种不同成份；(2)某些材料取材不便，如羊血需要新鲜采集，现采现用；(3)各种成份浓度配比需要足够精确，否则严重降低复苏效率，有时甚至使VBNC菌得不到复苏。

随着VBNC细菌研究领域的不断扩大和深入，原有复苏方法中存在的缺陷需要进一步得到克服和解决。

发明内容

本发明目的在于提供一种用料少、取材方便的VBNC沙门氏菌的复苏液。

它是由下列的重量份组成：血清1份、灭菌纯水1～3份。

所述的血清是指牛血清或胎牛血清，所述的灭菌纯水是选自经过高压蒸汽灭菌的纯净水、双蒸水或用微孔滤器除去水中杂质的普通蒸馏水。

优选为：血清1份、灭菌纯水2份。

本发明另一个目的是提供本发明VBNC沙门氏菌的复苏液制备方法

该方法包括：

血清和灭菌纯水，按所述的比例，混合搅拌混匀，然后用微孔滤器过滤除菌。

为了保证本发明VBNC沙门氏菌复苏液质量，需对其进行无菌检验，检验用按常规方法配制的SS琼脂平板，将过滤除菌的VBNC沙门氏菌复苏液均匀涂布于SS琼脂平板上，倒置于温箱中，37℃厌氧或需氧培养1～2天，无任何菌落生长，表明复苏液合格，分装，置于-20℃保存。

本发明又一个目的是提供VBNC沙门氏菌的复苏方法。

该方法包括：

(1)将进入VBNC的沙门氏菌，用灭菌生理盐水清洗，6000～8000r/min离心3～5min，弃上清；

(2)将步骤(1)菌体沉淀物和本发明VBNC沙门氏菌的复苏液混匀，置于热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2min～1.5h；

(3)将菌体沉淀物倒入适于沙门氏菌液体培养基中培养；

步骤(3)所述的培养基为SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220r/min，培养8～48h。

步骤(2)所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，是从5℃开始直到36℃，每个整数温度热处理2min，37℃热处理1h。

所述的热程控循环仪复苏升温与温育时间程序，为5℃温育20～30min，10℃温育20～30min，10℃温育20～30min，25℃温育20～30min，37℃温育1～1.5h。