[发明专利]高效生产犬白细胞干扰素的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种高效生产犬白细胞干扰素的方法。

背景技术

犬病毒性疾病仍是当前严重制约养犬业健康发展的主要传染病。而传统的传染病治疗方案临床上有时难以凑效，尤其针对病毒病办法不多。犬病毒性疾病至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草药制剂预防和治疗犬病毒性疾病的试验，但治愈率较低。抗生素及磺胺类药物基本无效。目前，犬干扰素是治疗犬病毒性疾病的有效药物。

存在的问题是：在犬白细胞干扰素的生产中使用常规用鸡新城疫病毒(NDV)诱导犬白细胞产生干扰素含量较低。

羧甲基茯苓多糖是一种具有新型免疫调节作用物质，能刺激人体免疫系统的功能，诱生和促生干扰素产生，也是一种的白细胞调节素。羧甲基茯苓多糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗放射、保肝、催眠等广泛的药理活性，能诱生与促诱生人血细胞产生干扰素-a(IFN-a)，干扰素-r(IFN-r)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-a(TNF-a)，与粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞活性因子。羧甲基茯苓多糖是一种新型的生物反应调节剂(BRM)。具有间接抗病毒、抗肿瘤作用。

但有关利用鸡新城疫病毒F株(NDV-F)和羧甲基茯苓多糖作复合干扰素诱导剂高效制备干扰素的方法目前还未见报道。

因此，提供一种干扰素含量高、制备成本低的高效生产犬白细胞干扰素的方法，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种高效生产犬白细胞干扰素的方法。

为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：

一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)无菌采集犬血，加入10μg/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1×10⁵-1×10⁷；

(2)白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于37℃水浴搅拌培养0.5-2小时；

(3)再加入羧甲基茯苓多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴搅拌培养1-2小时；

(4)然后在上述白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃摇床搅拌培养18-24小时；

(5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH 2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH 7.0，即得粗制犬白细胞干扰素。

本发明的有益效果是：犬基因工程干扰素具有制备成本高，在临床推广中受到很到限制。本发明利用犬血制备犬白细胞干扰素的方法：其具有很多优点：制备成本低，疗效好。常规用NDV-F诱导犬白细胞产生干扰素含量低，

本发明在NDV-F株诱导白细胞干扰素过程中加入羧甲基茯苓多糖，显著提高利用犬血制备犬白细胞干扰素的含量，显著降低了药物的成本。本产品注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。

具体实施方式

以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：

实施例1

一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，具体步骤如下：

(1)白细胞制备

无菌采集犬血，加入抗生素和抗凝剂，4.0℃冰箱放置。以2000-4000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1×10⁶。白细胞的分离应在采血后48小时内进行。活细胞数应达到90％以上。

(2)诱生病毒

采用新城鸡瘟病毒(NDV)F株，血凝效价达到适宜滴度方可投产。

(3)培养液

采用细胞培养基RPMI-1640，内含5-10％犬血清和10μg/ml卡那霉素或庆大霉素，也可用其它适宜培养液。

(4)生产用原水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。

(5)粗制干扰素的制备工艺

(5.1)诱生病毒的制备

采用9-10日龄健康鸡胚，于每胚的尿囊腔内接种适量NDV-F，37℃培养48-72小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿囊液，并做无菌试验，检验合格后合并，抽样做效价测定，放-20℃待用；

(5.2)白细胞悬液