[发明专利]一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用

说明书

【技术领域】：

本发明属于生物检测及临床医学检测技术领域，涉及活细胞或者组织中NO的 测定，特别是一种可用于活细胞中NO成像测定的铜配合物荧光探针及其应用。

【背景技术】：

NO是一种分子小、结构简单的气体，难溶于水，极易通过细胞膜扩散。由于 其分子中有一未配对电子，具自由基结构，极不稳定，容易与氧、超氧化物自由基、过渡金属离 子起反应。在组织内的半衰期极短，一般小于1min，但在组织外或有氧气条件下半衰期可延长至 4min左右。NO能很快被氧化成硝酸盐或亚硝酸盐，与超氧化离子、血红蛋白以及含血红素蛋白质 结合.而失去生物活性。80年代末发现内皮细胞舒张因子(EDRF)就是NO，因此有关NO的研究开 始兴起。现已查明NO在细胞内信息传导方面起着重要的作用，它既兼有第二信使和神经递质的性 能.又是杀伤肿瘤细胞及寄生虫等效应分子。正是由于NO的生物重要性.研究推测NO可能对某 些疾病，如细胞增殖病、新生儿缺氧缺血性疾病及细胞的凋亡、生长及死亡方面影响较大。因此， 研究NO的检测技术具有很高的应用价值。

由于NO在生物体内含量低，半衰期短，有氧气存在条件下极易被氧化，这就给其准确测定带 来困难。目前主要采用测定NO的稳定代谢终产物硝酸盐，亚硝酸盐间接反映NO含量的方法。硝 酸盐可用硝酸盐还原酶或镀铜镉法将其还原为亚硝酸盐再与Griess试剂发生重氮化反应，生成橙红 色化合物λmax＝546nm，显色度与亚硝酸盐浓度成正比。

化学发光法根据NO可与臭氧发生化学反应形成激发态二氧化氮，后者在返回基态过程中释放 能量，部分能量以光子形式发射，利用敏感的光电倍增管来检测光子的发射强度，以此推算NO含 量。此法具有高灵敏度和高特异性的优点，尤其适用于呼出气NO含量的检测，但由于存在金属、 玻璃、塑料等固体材料，NH₃、烯等气体，以及NO易溶于液体等因素的干扰作用，其临床应用受 到一定限制。其它还有高效色谱法、高铁血红素法等，由于需要特殊仪器，操作繁杂，难于在临 床推广使用。

由于现在的NO检测技术局限于将NO先氧化成亚硝酸盐或硝酸盐后再测定，无法实现实时直 接的测定，使得测定结果的科学性受到质疑。

荧光光谱测定是一种灵敏的化学检测手段，其检测下限一般可达到纳摩尔(10^-9摩尔)甚至皮 摩尔(10^-12摩尔)级。自1995年以来，世界各个实验室致力于开发NO的生物荧光检测试剂，如二 氨萘及其衍生物(Diaminonaphthalene，DAN)，二氯荧光素(dichlorofluorescin，DCFH)，二价铁和 钴离子的配合物，二氨基荧光素(DAFs)和二氨基罗丹明(DARs)等等，但目前存在的各种荧 光检测试剂存在着各种缺陷妨碍其进一步应用，如缺乏NO检测专一性(DAN和DCFH)，检测灵敏 度低(二价铁和钴离子的配合物)，需要其他反应物(典型为分子氧)的参与(如DAFs和DARs) 等等，使得细胞内或机体内的NO检测进展缓慢。目前应用的最成功的NO荧光检测试剂是DAF和 DAR，但由于和NO反应激活荧光时需要O₂的参与，尽管其是通过直接和NO反应生成荧光进行检 测，但在一定条件下(如无氧环境中的细胞或组织)仍然不能实现NO在细胞内或者机体内的实时 三维空间检测。

铜离子和一些荧光基团形成的配合物在近期受到了大家的关注，Cu(II)形成的配合物具有 合适的氧化性，在溶液中或生理条件下可以和NO发生反应，形成新的荧光化合物，Cu(II)被 还原成Cu(I)，这是一种很灵敏的激发(turn-on)荧光检测法，并且不需要其他任何反应物的参 与。苯并咪唑或萘并咪唑类衍生物是一类荧光性质优秀，斯托克斯位移较大，较为稳定的激发态 分子内质子转移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT)型荧光化合物，它们的最大 激发波长在350nm左右，与经典的细胞凋亡检测荧光染料DAPI位于相同的区域，大部分荧光显 微镜均配备有相应的激发滤光片，易于进行检测。它们可以和铜离子形成稳定性适中的配合物， 在跟NO反应后，激发出荧光。并且由于它们的荧光性质比较稳定独特，在细胞内可以和其他荧 光染料结合进行双染色，进一步精细化检测结果。

【发明内容】：