[发明专利]一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌及其应用。 

背景技术

中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1％。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。 

腺苷蛋氨酸(SAM)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAM还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAM于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAM上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。 

目前，SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。 

化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体(CH3I)合成，腺苷蛋氨酸有(+)和(一)两种构型，只有(一)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(+)腺昔蛋氨酸，且难以分离。发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷蛋氨酸，是60年代至80年代生产腺普蛋氨酸的主要方法。酶促转化法主要利用腺苷蛋氨酸合  成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔蛋氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷蛋氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。 

要将酶促合成法应用于工业化生产，大量获得催化用的腺苷蛋氨酸合成酶成为关键，规模化生产腺苷蛋氨酸合成酶的难题一直困扰着酶促转化法的工业化应用。本发明采用基因工程重组技术，获得了高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌，对酶促催化腺苷蛋氨酸的工业化生产具有重要意义。 

发明内容

(一)要解决的技术问题 

本发明的目的是提供一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌及其应用，本发明的又一目的是提供一种腺苷蛋氨酸合成酶的重组表达载体及其应用。 

(二)技术方案 

本发明提供了一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299。该菌株已于2007年12月26日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2299。 

该重组大肠埃希氏菌的构建方法包括如下步骤： 

(1)用PCR法扩增编码大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因； 

(2)将得到的PCR产物克隆到连接载体pBR322上，得到重组表达载体pMETK； 

(3)将重组表达载体pMETK转化大肠埃希氏菌DH5α，筛选阳性转化子，得到表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌。 

本发明还提供了一种腺苷蛋氨酸合成酶的重组表达载体pMETK，它是将编码大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因克隆到连接载体pBR322上得到的。 

本发明所述的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299  能高效表达腺苷蛋氨酸合成酶，可应用于工业化合成腺苷蛋氨酸。 

本发明所述的重组表达载体pMETK也可应用于工业化合成腺苷蛋氨酸。 

(三)有益效果 

本发明提供的表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCC No.2299，其腺苷蛋氨酸合成酶的表达量占菌体可溶性蛋白的31.36％，比野生菌高16倍；表达的腺苷蛋氨酸合成酶活性高达7.38U/ml，比野生菌高22倍。 

本发明所述的菌株已于2007年12月26日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2299。 

附图说明

图1是重组表达载体pMETK的结构图；