[发明专利]一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒有效
申请号: | 200810056359.5 | 申请日: | 2008-01-17 |
公开(公告)号: | CN101236206A | 公开(公告)日: | 2008-08-06 |
发明(设计)人: | 沈青春;宁宜宝;高和义;覃青松 | 申请(专利权)人: | 中国兽医药品监察所 |
主分类号: | G01N33/569 | 分类号: | G01N33/569;G01N33/531 |
代理公司: | 北京君智知识产权代理事务所 | 代理人: | 向华 |
地址: | 100081北*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 种猪 肺炎 支原体 重组 抗原 elisa 检测 试剂盒 | ||
1.一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒,其特征在于:试剂盒中设有试剂盒内设有抗体检测板,酶结合物工作液,阳性对照,阴性对照,样品稀释液,10×浓缩洗涤液,显色液A,显色液B和终止液,该试剂盒的检测板为猪肺炎支原体膜蛋白P46基因突变体蛋白抗原包被的可拆96孔酶标板,酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体,阳性对照未猪肺炎支原体标准阳性,阴性对照为无猪肺炎支原体标准阴性血清。
2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒,其特征在于:
1)猪肺炎支原体膜蛋白P46基因突变体蛋白抗原的制备为将猪肺炎支原体国际标准株232株P46基因ORF中含有3个编码Trp的TGA已突变为在大肠杆菌里可以通读的编码Trp的密码子TGG的基因,选择其亲水区的714个碱基序列进行扩增后克隆到pET28a(+)载体,并转化到受体菌——大肠埃希氏菌DH5α,该重组菌命名为:大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-P46株,并于2008年01月10日送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心,保藏号为:CGMCC No.2335),经IPTG诱导高效表达,经裂解、尿素沉淀、透析而获得;
2)抗体检测板的制备条件为,使用pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液,将纯化的P46蛋白作为抗原按照所测定的最适包板浓度稀释后,进行包板,每个样孔100μL抗原,置2~8℃放置12~24h,用5%的蔗糖的样品稀释液覆盖后抽空封装,置2~8℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒,其特征在于:
1)酶结合物工作液为:商品化的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体,按其使用说明的推荐稀释倍数进行验证试验,按试验结果进行矫正,酶标二抗直接加在二抗稀释液中,二抗稀释液为:氯化钠8.0g,KH2PO4 0.3g,Na2HPO4.12H2O 5.33g,KCl 0.2g加注射用水至900mL,加入5%~10%的脱脂奶粉后充分溶解后,调整pH至7.2~7.4,加入0.01%~0.05%硫柳汞,加注射用水定容至1000mL;
2)样品稀释液为:氯化钠8.0g,KH2PO4 0.3g,Na2HPO4.12H2O 5.33g,KCl 0.2g加注射用水至900mL,加入5%~10%的脱脂奶粉后充分溶解后,调整pH至7.0~7.2,加入0.01%~0.05%叠氮钠,加注射用水定容至1000mL;
3)10×洗涤液为100mL注射用水中,加有1mL Tween-20,和含0.05%硫柳汞;
4)显色液A为200mgTMB加入到100mL无水乙醇中;显色液B为含Na2HPO4 14.6g、柠檬酸9.33g,加注射用水至900mL,调pH至5.0~5.4,补加注射用水定容至1000mL;其工作液为10mL显色液B加入9mL双蒸水,再加入1mL显色液A,混匀后加入50μL0.75%过氧化氢尿素;
5)终止液为2mol/L的硫酸溶液。
4.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒,其特征在于:所说的阴性对照、阳性对照是:取临床通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阳性,解剖后肺脏有明显的猪肺炎支原体病变的猪血清,用样品稀释液进行50倍稀释即为标准阳性血清;取临床通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阴性,解剖后肺脏无任何猪肺炎支原体病变的猪血清,用样品稀释液进行50倍稀释即为标准阴性血清。
5.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体重组抗原ELISA检测试剂盒,其特征在于其检测程序为:
1)将10×洗涤液加入蒸馏水稀释成1×洗涤工作液;将待检样品用稀释液进行50倍稀释;
2)在抗原包被板上分别设定两个阳性对照和阴性对照孔,并加入标准阳性血清和标准阴性血清,每孔100μL;
3)在各待检样品加入检测样孔中,100μL每孔,用自封口袋装好后置室温30min;
4)将各样孔中的液体倒掉后用1×洗涤液洗涤,每孔350μL,洗涤3~5遍;
5)加入酶标二抗工作液,100μL每孔,用自封口袋装好后置室温30min后重复步骤3);
6)加入显色工作液100μL,室温显色15min;
7)向每个样孔加入终止液50μL终止显色,在450nm下测定其吸光值;
8)检测样本的判定标准为:待检血清与对照阳性血清分别减去对照阴性血清OD值后的比值:S/P≥0.4,则判为阳性,S/P≤0.3判为阴性,介于二者之间为可疑。
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