[发明专利]一种阿魏酸酯酶的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种阿魏酸酯酶的提取方法，具体的说，是一种从瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法。

背景技术

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主要反应为：多糖-阿魏酸酯+H₂O→阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。

近年来，阿魏酸酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。秸秆和饲草干物质中约30％～80％为细胞壁成分，然而，反刍动物对这些细胞壁的消化利用率不超过50％。因此，细胞壁成为反刍动物消化秸秆和饲草的瓶颈因素。阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测为消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。

人们发现不仅微生物可以向胞外分泌阿魏酸酯酶，哺乳动物和植物细胞也可产生阿魏酸酯酶。在此基础上，人们对这些酯酶的纯化和酶学特性进行了一定的研究，获得了相应的基因、蛋白质序列和三维结构。目前，对阿魏酸酯酶的纯化研究多集中于从单菌培养液中提取，分离提取处理过程与其它酶制剂相似，即通过离心除去菌体，然后对上清液进行超滤、硫酸铵沉淀及各种层析等处理，得到阿魏酸酯酶。单菌培养液中组分比较单一，阿魏酸酯酶的种类较少，提取过程较为简单。但对于成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液，则需要更为全面有效的分离步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种可从瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液中分离纯化阿魏酸酯酶的方法，该方法可以全面有效地从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中分离出各种阿魏酸酯酶。

本发明通过各种分离纯化步骤地有机结合，从瘤胃液或培养液中分离阿魏酸酯酶。具体的说，瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液经过滤离心、超滤浓缩、加热、离子交换层析、疏水层析及分子筛层析得到阿魏酸酯酶。

本发明所提供的方法，其具体操作步骤如下：

1)过滤离心：将新鲜的瘤胃液或培养液样品经四层医用纱布过滤，滤液经20,000×g 4℃离心30分钟，去除菌体沉淀，收集上清液备用。

2)超滤浓缩：取上清液通过超滤膜进行超滤浓缩。首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集＜100KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去＜10KDa的部分，10-100KDa和＞100KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在4-10℃之间，酶回收率可高达55％。

3)加热：根据不同阿魏酸酯酶的热稳定性不同，将超滤得到分子量在10-100KDa之间的浓缩液在50-70℃加热20-40分钟，10,000×g 4℃离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。

4)离子交换层析：将分子量＞100KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓缩液透析，浓缩，加入适量200mM磷酸钠缓冲液(pH7)和适量去离子水，混匀，用强阴离子交换层析柱Q Sepharose Fast Flow column进行分离，其上柱速度为0.5mL/min-5mL/min，优选为2mL/min。未结合的物质用50mM磷酸钠缓冲液(pH7)洗提，结合的蛋白质用梯度NaCl(0-1M)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗提，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于适量1M(NH₄)₂SO₄50mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。

5)疏水层析：将离子交换层析后制得的酶液先经0.45μm滤膜过滤，取适量用强疏水性预装柱HiTrap Phenyl FF column分离，其上柱速度为0.5mL/min-4mL/min，优选为0.5mL/min。未结合的部分用含1M(NH₄)₂SO₄50mM的磷酸钠缓冲液(pH7)洗脱。结合的部分用下降的梯度(NH₄)₂SO₄(1-0M)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗脱。收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于适量50mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。