[发明专利]固相载体化的交联酶聚集体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及固定化酶，尤其涉及固定于固相载体上的交联酶聚集体及其制备方法，属于酶的固定化领域。

背景技术

从上个世纪60年代开始酶的固定化研究以来，人们从各个方面对酶的固定化技术进行探讨和研究，已经成功地运用了物理和化学的方法对酶进行了固定化，其中许多的技术和产品在工业生产中得到了应用。但固定的对象基本上都是游离酶，由于游离酶是对环境要求较高，比较脆弱的可溶性蛋白质，一般情况下，对热、强酸、强碱均不稳定。在常用的固定化方法中，由于较强烈的化学反应，通常对蛋白质的性质造成极大的影响，由于酶又具有一定的高级空间结构，极易受到表面活性剂、载体表面物理性状、化学接枝等因素的影响，对酶的空间结构或活性中心造成不可逆的破坏，使得酶活力下降、或失活，严重影响了固定化酶的效果和使用。

2002年荷兰Delft大学Sheldon小组提出用蛋白质沉淀剂沉淀酶蛋白，得到具有稳态结构的酶聚集体，再用戊二醛交联，制备了交联酶聚集体(Cross Linked EnzymeyAggregates，CLEAs)。对七种商业化的脂肪酶进行了聚集体交联，得到了具有较好酶活性的无载体固定化酶(P.Lopez-Serrano，L.Cao，F.van Rantwijk & R.A.Sheldon etal.Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity：application tolipases.Biotechnology letters，2002，24：1379-1383)。2003年董晓毅对脲酶进行了聚集体交联，获得了具有较好稳定性的交联脲酶聚集体(董晓毅、夏仕文交联脲酶聚集体的制备和初步应用[J].生物工程学报，2003，19(3)：332 336)。

聚集体交联酶(CLEAs)是继交联溶解酶(CLEs)、晶体交联酶(CLECs)后发展起来的一种固定化的酶，属于无载体固定化的范围。由于聚集体交联酶中酶分子处于稳态结构，所以形成的固定化酶具有热稳定性高，抗胰酶能力强等特点。但由于聚集体交联酶是无载体固定化，具有高度的分散性，所以丢失了固定化酶的最主要的特点：反应完毕后难于回收利用；没有一定的物理形态，在工业化生产中不能用于连续性生产。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服聚集体交联酶所存在的不能回收再利用的缺点，提供一种固定于载体上的交联酶聚集体，该交联酶聚集体除具有热稳定性高，抗胰酶能力强等优点外，还具有一定的物理形态和稳定结构，可以回收利用，能够连续应用于生产。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种固定于固相载体上的交联酶聚集体，其中，所述的固相载体是多孔微球。

所述的多孔微球可以由各种材质制成，例如，可以由有机材料(例如有机高分子多孔材料等)、无机材料(多孔玻璃、多孔陶瓷等)等材料制成；用所述的多孔微球作为交联酶聚集体的固相化载体，无需对其进行特殊处理，只要其主要孔隙大于待固定的蛋白质分子大小的1～2倍即可。优选的，本发明所述的多孔微球的平均孔径为10nm～300nm之间，更优选为30nm。

适用于本发明的可固定化酶的范围非常广泛，只要是能够被蛋白质沉淀剂沉淀的酶(或者说采用现有的聚集体交联技术可将其制备成聚集体交联酶，这类的酶都可适用于本发明)基本上均可作为本发明固定化酶的对象，例如，可以是有机磷降解酶、乳糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶等，优选为有机磷降解酶、乳糖酶。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述固定于固相载体上的交联酶聚集体的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备固定于固相载体上的交联酶聚集体的方法，包括酶蛋白的沉淀、交联，其特征在于：首先让需要固定的游离态酶分散于多孔微球中；再依次在多孔微球内进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球，即得。

优选的，所述的分散方法包括：将游离态酶溶于缓冲液中后加入多孔微球，缓慢搅拌，让游离态酶分散于多孔微球中；更优选的，将游离态酶溶于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为0.1-1.5mg/ml的酶溶液(更优选为配制成0.4-0.5mg/ml的酶溶液)，在4～25℃温度条件下缓慢搅拌1～3小时，让游离态酶分散于多孔微球中。