[发明专利]一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基。

背景技术

动物细胞培养是一种应用最为广泛的体外培养技术，该技术起源于19世纪。1885年科学家把鸡胚的神经板在温热的盐水中成功地维持存活了若干天，是首次体外培养的尝试。随着抗菌素、合成培养液、胰蛋白酶处理技术的发展以及器皿的改进，动物细胞培养技术得到了飞速的发展。培养液的选择和配制是体外培养技术的一个关键环节。一般培养液由2部分组成：基础培养基和血清。

基础培养基  自行配制或用现成的化学合成培养基，常用的化学合成培养基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、TCM199、RPMI1640、EBSS、HBSS等等。这些化学合成培养基具有适当的渗透压、能源、氨基酸、维生素、微量元素及缓冲pH值，可以满足许多类型培养细胞的最基本的需要，它虽可维持细胞一段时间的存活，但由于缺乏细胞有丝分裂所必需的各种激素和生长因子，细胞不能在这类相当于平衡盐溶液的体系中进行分裂。要想使细胞进一步增生、生长必须添加血清。

血清  可以提供细胞生长所需的各种激素和生长因子，目前已成为维持细胞有丝分裂不可缺少的物质。常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清和马血清等。培养基中血清的浓度范围为5～20％，以10％浓度最为常用。但血清有一系列缺点，特别是它的易变性和非限定性，给实验工作带来了难以精确定量和难以重复等困难。因此，尽管它的应用已有相当长久的历史，但决不是理想的培养基成分。

20世纪60年代利伯曼和奥维等首先进行了无血清培养的尝试，经山根、佐藤春太郎等科学家的研发，一些无血清培养基(又称无血清限定培养基或简称限定培养基)已经在一些细胞培养中开始使用。这类培养基主要以各种激素(如胰岛素、各种前列腺素、生长激素等)、生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、MSA等)、维生素、载体蛋白如转铁蛋白(铜蓝蛋白等)、微量元素(镉、硒等)、乙醇胺以及贴壁与展开因子(如昆布氨酸、纤维网素等)取代含血清培养基中的血清部分。这样，不但排除了血清的干扰，而且，还可以在更接近体内的条件下维持细胞的功能和活力。山根等发现，不同组织学类型的细胞所需要的活性物质完全不同，而不同动物的同一组织学类型的细胞所需要的活性物质则极为类似，仅在量上有所区别。据此，他们提出“组织定型专一培养基”的概念，以图设计出专一地适用于各种细胞类型的无血清培养基。可以预料，由于无血清培养基的发展，许多有关细胞培养的生物学研究工作将由定性研究进展到定量研究。

随着奶牛业的发展，牛的胚胎工程也发展迅速，体外大规模生产胚胎成为可能。但是体外生产的胚胎，胎牛体形偏大，常常造成难产，给生产造成巨大的损失，严重制约着牛胚胎体外生产和胚胎移植的产业进一步向前发展。大量研究表明，培养液内添加血清是造成牛胎儿肥大综合症的主要因素之一。一些印迹基因调控着胎儿的体重，如Igf2，H19和Igf2r等基因，而血清对印迹基因正常表达有着不利影响。在早期胚胎发育中发现，这些基因在无血清培养胚胎的mRNA丰度远远高于含血清培养的胚胎，可见血清影响了这些基因的正常转录。所以用含有血清培养基生产的胚胎，移植后出生的个体往往是体重偏大。此外，血清中一些成份不利于胚胎基因的正常表达，进而影响胚胎进一步发育，造成体外胚生产牛胎妊娠率和产犊率低。尽管血清可以提供体外卵母细胞生长发育所需的营养物质，但它的副作用也是不容忽视的。用含有血清的培养液培养卵母细胞会导致胞质内脂滴增多，线粒体数量下降，严重地影响受精后胚胎的脂肪和能量新陈代谢，干扰了胚胎发育过程基因正常表达，致使胚胎的质量下降，所以用含有血清培养液生产的胚胎，其妊娠率和产犊率有所降低。

另外在一些特定实验情况下，如需观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时很难排除血清中生长因子的干扰作用。血清含有蛋白成分诱导细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)，这些产物和血清内的蛋白成分影响了卵母细胞的正常生长发育。

总之，无血清培养剂这一新技术在细胞生物学方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利于探讨和阐明细胞体外培养生理、生化和成分生物合成等一系列问题，而且一些生产中问题得以解决，将可以为防病治病做出很大的贡献。

发明内容

本发明针对血清对牛卵母细胞体外成熟的缺陷，提供一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，不仅有利于阐明培养基成分对卵母细胞发育的作用，也能克服目前牛胚胎生物工程中存在的一些问题。