[发明专利]斯达油脂酵母菌内醚糖激酶基因的克隆方法及其基因序列和用途

权利要求书

1. 内醚糖激酶基因，其特征在于，是从斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi YZ-215克隆得到。

2. 如权力要求1所述的斯达油脂酵母，其特征在于，在其培养液中，内醚糖为唯一碳源和能源，并高效同化利用。

3. 内醚糖激酶分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，细胞破壁；

收集培养好的斯达油脂酵母的菌体，用20mM Tris-HCl缓冲液(1mM EDTA，1mM DTT and 0.1mM PMSF)洗涤菌体两次，按每克湿菌体加入4ml相同比例的上述缓冲液，在冰浴条件下，超声波50 kHz、间断处理40分钟，20,000rpm离心20分钟，取上清液。

第二步，硫酸铵沉淀；

上清夜中加入固体硫酸铵至30％的饱和度后缓慢搅拌1小时，离心收集上清，继续加入固体硫酸铵至60％的饱和度，静止1小时，离心收集沉淀并用少量20mM Tris-HCl缓冲液溶解；

第三步，离子交换层析；

将上述样品上Resource Q(Amersham Biosciences，USA)阴离子交换拄，缓冲液为20mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0，50mM NaCl)，洗脱液为盐离子浓度梯度为0.05-1.0M NaCl的Tris-HCl缓冲液，收集酶活性洗脱峰；

第四步，凝胶层析；

在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡后的Superdex^TM200 10/300 GL柱中上样，洗脱液为50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，洗脱速率为0.2ml/min。

收集酶活性洗脱峰，在Superdex^TM200 10/300 GL柱中再洗脱一次，收集酶活性洗脱峰，得到电泳级纯的内醚糖激酶；

整个纯化过程在Akta FPLC系统(Amersham-Pharmacia Biotech)中进行，紫外280nm下监测蛋白浓度。

4. 胶内酶切的方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

按常规方法制备12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样后电泳，考马斯亮蓝染色；切下蛋白质条带；

第二步，脱色；

用含有50mM NH₄HCO₃和100mM的乙腈的脱色液脱色两次，每次20分钟；用100μl的乙腈洗涤除去残余液体，再用100μl的乙腈洗涤10分钟，然后真空干燥离心；

第三步，酶解；

在含有酶解缓冲液中(50μl H₂O，50μl 100mM NH₄HCO₃，5μl 100mM CaCl₂，and 15μl 0.1μg/μl trypsin)4℃浸泡45分钟，用不含trypsin的相同缓冲液更换上清液，37℃酶解16小时；

第四步，抽提；

肽段用5％三氟乙酸和50％乙腈抽提两次；

第五步，干燥：

-75℃干燥16-20小时；。

5. 肽段的氨基酸序列测定特征在于，用MALDI TOF MS鉴定肽段，用ESI-Q-TOF MS/MS测定肽段氨基酸序列；。

6. RACE反应，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，提取从斯达油脂酵母的总RNA：

采用北京天根生化公司试剂盒(TRNzol)；

第二步，设计基因特异引物：

根据权利要求5所述测定出的两条肽段的氨基酸序列推出正反4条DNA序列；

第三步，反转录：

采用Invitrogen公司RACE试剂盒反转录合成cDNA；

第四步，PCR反应：

采用Invitrogen公司RACE试剂盒，Nested PCR得到两个大小分别若为500bp和800bp的此酶的基因片段。

7. DNA测序，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，将权利要求6所述的两个基因片段分别克隆到载体(Invitrogen公司RACE试剂盒)；

第二步，在上海生物工程有限公司测得该酶的基因两个末端序列。