[发明专利]一种产白僵菌素的盾叶薯蓣内生镰孢菌及其抗细菌活性

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种其代谢产物为白僵菌素的微生物一盾叶薯蓣内生镰孢菌。

背景技术

植物内生真菌(plant endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，宿主植物不表现外在病害症状的真菌。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生生物碱类、肽类、甾体类、萜类、酚类、醌类、脂肪族类、异香豆素类等多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、工业、食品等领域具有重要的应用前景。

白僵菌素(beauvericin)是一种具有抗菌、杀虫、抗癌、抑制胆甾醇酰基转移酶活性、引发细胞程序性凋亡等生物活性的脂肽类化合物，最早在真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)中发现。白僵菌素具有环状的化学结构，由3个2-羟基异戊酸和3个N-甲基苯丙氨酸通过肽键和酯键交错相连而成，分子式为C₄₅H₅₇N₃O₉，分子量为783.4。白僵菌素的活性研究集中在杀虫活性上，对微生物抑制活性的报道较少。

盾叶薯蓣(Dioscoreazingiberensis C.H.Wright)在分类上属于单子叶白合目薯蓣科(Dioscoreaceae)，为我国特有的药用植物，分布于湖南、湖北、四川、甘肃等省区，其根状茎多年生长在地下，对土传病原菌具有强的抵抗能力，这很可能与其共生的内生菌有关。

目前尚未见从盾叶薯蓣内生真菌中分离纯化单一化合物的报道。本发明着重于内生真菌提取物抗菌活性的研究，为探讨内生真菌的生理生态功能(如提高宿主的抗病性等)提供依据。

本发明的目的是提供一种经发酵培养能产生白僵菌素成分的微生物，即盾叶薯蓣内生镰孢菌。

发明内容

本发明涉及一种镰孢菌(Fusarium sp.)，菌株代号为Dzf2，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年1月16日，登记入册编号为2340。本发明提供如下的技术方法。

1、内生镰孢菌Dzf2的分离

采集新鲜的盾叶薯蓣根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Dzf2。

2、内生镰孢菌Dzf2的形态特征

(1)无性世代：菌株Dzf2在PDA培养基上25℃培养，产生大量的气生菌丝，白色，边缘菌丝稀疏，菌落背面桔黄色，分生孢子梗单生或轮生，瓶梗状，基部有分隔，人孢子近镰刀形，2-3个隔，小孢子卵圆形，椭圆形，肾形无隔或者1个隔，孢子大小4.3-24μm×2.4-5μm。内生真菌Dzf2的形态特征(见图1、图2、图3和图4)符合镰孢菌属(Fusarium)真菌的形态特征。

(2)有性世代：未发现。

3、内生镰孢菌Dzf2的分子生物学特征

运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。将Dzf2菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accession number)DQ446211。同时将Dzf2菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Dzf2菌株的ITS序列与芬芳镰孢菌(Fusarium redolens)X94169的ITS序列相似度为99.5％，其同源性的系统发育树图见图5。

4、内生镰孢菌Dzf2的发酵培养特征

培养基：液体马铃薯-葡萄糖(PD)培养基。

培养温度：25±1℃。

发酵时间：7天。

摇床转速：120rpm。

发酵培养特征：培养第2天，菌液无色；培养第5天，菌液略带橙黄色：培养第7天，菌液为灰黑色。

5、内生镰孢菌Dzf2粗提物的抗菌活性