[发明专利]一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法

权利要求书

1.一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：

(1).罗布麻分枝调控基因CUC3保守区的克隆；

应用RT-PCR方法，提取罗布麻总RNA反转录产生cDNA，以cDNA为模板克隆分枝调控基因CUC3保守区基因片段，并根据反义RNA基因沉默原理构建反义表达载体；

CUC3基因片段的克隆：从罗布麻无菌种子苗中制备总RNA，通过反转录反应产生cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板进行RT-PCR反应，根据Genbank中收录的CUC3基因保守区的序列设计1对兼并引物，其序列为：

Primer1：5′-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3′；

Primer2：5′-CCTTTGTAGAAC/AACC/AAA/GC/TGTC/TTTCTTC-3′

(2).基因沉默载体的构建；

将RT-PCR的目的产物片段插入克隆载体pEASY-T1，然后进行DNA序列分析，测序结果与Genbank中序列进行同源性比较；

将测序正确的CUC3基因片段用XbaI和SacI从pEASY-T1切下，反向插入含有35S启动子和NOS终止子的表达载体pCAMBIA-1301，构建成反义表达载体pCAMBIA-1301-CUC3；

(3).通过发根农杆菌介导的方法进行基因转移；

采用冻融法将反义表达载体pCAMBIA1301-CUC3导入发根农杆菌，涂布含50-100mg/L卡那霉素的YEB平板后，在28℃恒温培养箱，培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染罗布麻真叶、茎、子叶节，子叶，下胚轴，根不同外植体部位；

(4).罗布麻的转化和转基因植株再生；

用导入反义表达载体的发根农杆菌感染罗布麻上述不同外植体部位，感染后的外植体在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有500mg/L头孢霉素的MS培养基，25±1℃，14h/10h光/暗培养，每隔5-7天转接一次，共转接3-5次，感染后约7-10天产生毛状根，待毛状根长至2-3cm，用PCR方法进行检测，将检测为阳性的根切下转至50mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的芽诱导培养基上进行筛选，待筛选到的芽长至2-3cm高时，转入生根培养基，经过2-3周培养，转化植株生根并长成完整再生植株；

(5).转基因植株的检测和筛选；

对转基因植株采取三步法筛选，第一步，通过采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株的目的基因，其PCR引物为步骤(1)中所述克隆CUC3保守区基因片段的兼并引物，Southern blot的DNA探针为35S启动子-CUC3保守区基因片段的全部序列，第二步，对检测为阳性的转基因株系，进行炼苗后，移栽到大田培养，在一个生长季后，对其分枝数进行单株统计，与同时期野生型种子苗比较后，筛选获得分枝较少的转基因罗布麻株系，第三步，多代筛选，将上一年收获的种子，大田种植后，进一步反复筛选，以获得稳定的表型和种质资源。

2.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征在于克隆得到的CUC3基因保守区基因片段的核苷酸序列为：

  1ATTACCTTTT ACTTAGCTTC CAAAGTCTTA TACGGACGCT TCTGTGGACT CGACATTGCT

 61GAAGTCGACC TCAACAGATG TGAGCCATGG GAGCTTCCCG ATGCAGCTAA GATGGGAGAG

121AGAGAGTGGT ACCTTTTCAG CTTAAGGGAC AGGAAGTACC CAACGGGGCT GAGAACAAAT

181AGAGCCACTT GTGCCGGGTA CTGGAAAGCA ACGGGGAAAG ATAGAGAAGT CTACGGCAGT

241GAAGGCGTTG TTGTGGGCAT GAAGAAGACA TTTGTTTTCT ACAAAGG。

3.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征在于该克隆得到的基因片段编码的氨基酸序列为：

 1ITFYLASKVL YGRFCGLDIA EVDLNRCEPW ELPDAAKMGE REWYLFSLRD RKYPTGLRTN

61RATCAGYWKA TGKDREVYGS EGVVVGMKKT FVFYK。