[发明专利]一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法

权利要求书

1、一种烟叶在线醇化的酶制剂的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

1)取鲜活烟叶或顶杈，破碎细胞，按体积比V_缓冲液∶V_汁液＝1∶9～10加缓冲液A：0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1M PMSF，于4℃，2600g离心20min；

2)取上清液，缓慢加入(NH₄)₂SO₄溶液至饱和，4℃缓慢混合30min，4℃15000g离心40min；

3)取上清液，加入等体积(NH₄)₂SO₄溶液，缓慢混合2小时或过夜，4℃15000g离心2h，收集沉淀，加缓冲液A：0.1M Tris-HCL，pH7.7，0.1M PMSF至沉淀充分溶解；

4)溶解完全后，按1∶0.1～0.2体积比加入缓冲液B：0.1M Tris-HCl，pH7.7，0.1％EDTA(W/W)于4℃沉淀20min，8000g离心10min，获上清液，弃沉淀；

5)上清液按1∶0.001～0.002体积比先后加入0.3％Ca(NO₃)2·4H₂O和0.2％MgSO₄溶液，充分混匀，静置8-12小时或过夜；

6)按1∶0.01～0.02体积比加入0.01％蔗糖低聚物溶液，静置1-1.5小时；溶液样品于-8℃干燥浓缩至原体积的1/8时停止，4℃解冻分装即获得烟叶在线醇化酶制剂原液。

2、一种用权利要求1所述的烟叶在线醇化的酶制剂的制备方法制备的烟叶在线醇化的酶制剂。

3、权利要求2所述的烟叶在线醇化的酶制剂的应用，其特征在于成品酶制剂在施用前用水稀释至0.1～0.3％，烟叶分片后在真空回潮至含水率15.5％时，均匀喷施于烟叶上。