[发明专利]铁皮石斛优质种苗快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是铁皮石斛优质种苗快速繁殖方法。

背景技术

石斛属(Dendrobium)为兰科(Orchidaceae)的一个大属，包括1600多种植物，我国约有63种，其中供药用的有30多种，主要有环草石斛(D.loddigesii)、马鞭石斛(D.fimbriatum)、铁皮石斛(D.candidum)、黄草石斛(D.chrysanthum)和金钗石斛(D.nobile)，铁皮石斛为其中最为珍贵者。中医认为石斛具有养阴清毒、生津止渴、明目强身的作用，现代医学研究发现石斛含有多种生物碱、多糖和氨基酸，具有增强免疫功能、抑制血栓形成、抗肿瘤和抗衰老的多种功效。因此在国内中医临床配方和出口外销中成药工业原料中需求量不断增加，国内、国际市场的售价一路飚升，使石斛日趋显得珍稀名贵。但野生石斛的自然繁殖率低、生长缓慢、收获产量低，远远满足不了市场的需要，加之人们长期无节制的滥采滥挖，造成野生资源的严重破坏。目前虽有石斛属植物组织培养和人工栽培石斛技术的研究，但均存在种苗生产周期长、生产成本高、繁殖系数低、质量参差不齐等问题，而满足于大规模工厂化生产的优质种苗快速繁殖方法没有报道。

目前，铁皮石斛组织培养技术的外植体多采用野生植株的蕨果内种子，经消毒接种至诱导培养基上形成原球茎，以建立无菌体系，该方法存在种子获取难、母本来源受限制、性状表现不一致、种苗品质退化快、经几次继代增殖后老化现象严重、优质种质难以保存等问题。

发明内容

本发明的目的是提供了一种短时间获得大规模铁皮石斛优质种苗的快速繁殖方法，该方法种苗外植体消毒效率高、培养基成分独特且成本低、繁殖周期短，生产出的种苗品质优良、整齐，应用价值高。

本发明通过从性状表现优异的野生或人工栽培的铁皮石斛植株中采取未展叶的新芽作为外植体，可在组培初期获得足够的外植体数量，保证后期规模化生产的成功率。即通过原球茎诱导——原球茎的继代增殖——成苗分化培养——壮苗生根培养——试管苗移栽一系列环节，可在6个月内建立起一整套工厂化无菌优质种苗生产体系。

本发明对数株采自广西省、云南省广南县与西双版纳州的野生或人工栽培的铁皮石斛植株的组织培养和快速繁殖技术、组培苗炼苗技术进行了系统研究，在大规模工厂化生产的角度对培养基配方、工艺流程、炼苗基质等方面有较大的创新，提供了一套铁皮石斛优质种苗快速繁殖方法和相关培养基配方、炼苗基质配方。具体包括如下步骤：

1.材料：取野生或人工栽培的铁皮石斛(Dendrobium candidum)。

2.外植体诱导材料消毒的方法：在2-4月上旬，切取野生或人工栽培的铁皮石斛未展叶新芽，流水冲洗10分钟，将外植体在超净工作台上用75％的酒精浸泡45秒后，再用质量百分比浓度为1克/升的氯化汞溶液、2～3滴吐温-80浸泡8分钟，无菌水冲洗3遍，用解剖刀剥除外部叶片，再放入质量百分比浓度为1克/升的氯化汞溶液、2～3滴吐温80中浸泡5分钟，无菌水冲洗3遍，逐层剥去叶片直至露出生长点，接种到1/2MS固体培养基上萌发植株，建立无菌体系。

3.原球茎诱导：切取无菌体系幼苗茎段或基部小组织块接种到原球茎诱导培养基：1/2MS+6-BA2.0-5.0毫克/升+NAA0.2-1.0毫克/升+马铃薯汁200克/升，马铃薯汁采用清汤法煮制经过滤而来，加入马铃薯汁能明显提高原球茎的诱导率。

4.继代增殖：培养30天左右，将原球茎转移到继代增殖培养基，固体培养与液体培养交替进行可显著提高原球茎的增殖率。固体培养基为1/2MS+6-BA1.0-3.0毫克/升+NAA0.1-0.5毫克/升+马铃薯汁200克/升+活性炭0.2-0.5克/升+琼脂7克/升；液体培养基为1/2MS+6-BA1.0-3.0毫克/升+NAA0.1-0.5毫克/升+马铃薯汁200克/升+活性炭0.2-0.5克/升。液体培养基的摇床转速为50-80r/min，培养温度25±2℃，光强度1500-2500lx，光照10小时/天。本培养阶段添加少量活性炭可以减少原球茎团褐化，降低6-BA与NAA的激素浓度可保证一定增殖率下发生变异的可能性。

5.成苗培养：将原球茎团接种到成苗培养基培养3-4周形成无根小苗。成苗培养基：1/2MS+6-BA0.1-0.5毫克/升+NAA1.02.0毫克/升+马铃薯汁200克/升+活性炭0.2-0.5克/升。