[发明专利]不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法

权利要求书

1.一种不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法，由样本DNA的提取、选择接头和预扩引物、AFLP引物筛选、AFLP扩增、AFLP-毛细管电泳检测、数据处理和分析六个步骤组成，其特征在于：(1)在AFLP引物筛选中，筛选出E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA两对扩增多态性最高的引物，用于AFLP分析，其序列如下， 

E-AAC：5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’ 

M-CTG：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’ 

M-CTA：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3’； 

(2)在AFLP-毛细管电泳检测中，选择性扩增样本检测在CEQ8000遗传分析系统上完成；其上样液：甲酰胺10ul，Size standard-6000.2ul，稀释10倍的Sample 3ul；电压：6KV，电流：4Ma，时间：50min；其扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，激光激发荧光采集数据，电泳结果通过软件自动统计分析并转化为“0、1”原始数据矩阵备用；同时，导出电泳分离图谱。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在样本DNA的提取中，样本各取1.0g，分别按照改进的CTAB法提取总DNA，提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，以确定其纯度和浓度，并将总DNA浓度稀释到200ng/ul，用于PCR反应。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 

EcoR I接头的核苷酸序列为5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、3′-CTGACGCATGGTTAA-5′； 

Mse I接头的核苷酸序列为5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′、3′-TACTCAGGACTCAT S′； 

EcoR I预扩引物的核苷酸序列为5′-GACTGCGTACCAATTC-3′(E0)、5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′(E1)； 

Mse I预扩引物的核苷酸序列为5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′(M0)、5′-GATGAGTCCTGAGTAAA-3′(M1)。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在AFLP扩增中，样本DNA经限制性内切酶EcoR I、Mse I分别酶切；双酶切产物加入EcoR I和Mse I接头序列和T4连接酶进行连接；连接产物加入EcoR I和Mse I引物进行预扩增，反应热循环程序为：94℃预变性2min，然后进入循环，每个循环94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共20个热循环，最后60℃延伸30min，4℃冷却后取出；预扩增产物稀释20倍后，加入选定的引物进行选择性扩增；选择性扩增为两段循环，94℃预变性2min后，第一段循环为：94℃变性20sec，66-56℃退火30sec，72℃延伸2min，共10个热循环；其中，退火温度从66 ℃开始，每个循环降1℃；第二段循环为：94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共20个循环，最后60℃延伸30min，冷却后取出检测；扩增反应在MJ Research PTC200-wellthermal cycler仪上进行。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：得到的原始数据矩阵，用POPGENE version1.32软件进行遗传多样性分析，获得居群遗传多样性以常规的多态位点百分率(P)，Nei′s基因多样性指数He，Shannon多样性指数Ho，基因多样度Ht；同时，进行电泳分离图谱的特征峰比对分析。